Wojciech Kluźniak Szczecin, dnia 18-01-10

Grupa 2b/ rok IV/ Biotechnologia

Ćwiczenie laboratoryjne nr 1

Konspekt

Temat: Oznaczanie stężenia DNA i jego czystości (spektrofotometr GeneQuant DNA/RNA Calculator), przygotowanie i przeprowadzenie reakcji nested-PCR z zastosowaniem starterów A i B komplementarnych do sekwencji rDNA kodującej (-ych) powstawanie podjednostki 5S RNA u wybranych, roślinnych, obiektów badawczych.

Cel ćwiczeń: Oznaczenie stężenia DNA oraz jego czystości, a także określenie zmienności w obrębie sekwencji rDNA kodującej powstawanie podjednostki 5S RNA za pomocą reakcji nested PCR. Amplifikacja matrycy reakcją PCR w celu wykorzystania jej w kolejnych etapach nested PCR.

Istota zastosowanej metody badawczej: Metoda ta polega na amplifikacji mniejszego odcinka DNA, zawartego w obrębie wcześniej amplifikowanego dłuższego fragmentu Oczywiście w tej drugiej reakcji stosowane są inne startery. Za pomocą tej metody możemy także zwiększyć czułość reakcji, dzięki dodatkowej amplifikacji produktów wcześniejszej reakcji. Stosowana jest w przypadku braku pewności, że zamplifikowany został właściwy fragment DNA. Metoda ta polega na zastosowaniu wewnętrznej pary primerów w stosunku do preegzystującego produktu amplifikacji (dwuetapowa amplifikacja).

Produkt tej reakcji może być stosowany jako:

1. sonda molekularna w hybrydyzacji,

2. kontrola specyficzności amplifikacji matrycy.

Amplifikacje PCR badanych materiałów przeprowadzono w oparciu o niżej zamieszczony protokół - skład mieszaniny reakcyjnej.

Proszę zamieścić tabelę ze składem mieszaniny reakcyjnej

Elektroforeza produktów PCR i krótkie omówienie wyników analiz:

W oparciu o zamieszczone w podsumowaniu do ćwiczeń (załącznik 1) zdjęcia (stosownie do użytych technik) proszę opisać otrzymane wyniki badań. Proszę wkleić stosowne do ćwiczeń fotografie żeli agarozowych i je opisać - myślę tu o wzorcach masowych itp.

Podsumowanie/Wnioski

Produkty PCR otrzymane w trakcie tych ćwiczeń zostały wykorzystane do kolejnego etapu nested-PCR

---