BADANIE NIESTABILNOŚCI GENETYCZNEJ I NARAŻENIA NA ZWIĄZKI MUTAGENNE

Niestabilność chromosomowa- zwiększona częstość złamań i innych uszkodzeń (aberracji strukturalnych i liczbowych) chromosomów w komórkach somatycznych badanej grupy w porównaniu do grupy kontrolnej

• jedna z cech charakterystycznych komórek nowotworowych

• Xeroderma pigmentosum, ataxia telangiectasia, Anemia Fanconiego

• niedobory syntezy naprawczej DNA

• korelacja pomiędzy wysoką spontaniczną łamliwością chromosomów a częstością występowania nowotworów

Testy pozwalające na wykrycie jawnych aberracji chromosomowych:

• test aberracji chromosomowych (CA)

• test wymian siostrzanych chromatyd (SCE)

• test mikrojądrowy (MN)

„Ukryta” niestabilność chromosomowa - w komórkach prawidłowych u osób z nowotworami- widoczna po dodaniu związku indukującego uszkodzenia

• wyraża się zwiększoną podatnością chromosomów na działanie związków klastogennych o bezpośrednim działaniu, które nie wymagają aktywacji metabolicznej

• związki klastogenne - indukują aberracje strukturalne chromosomów

• są to: bleomycyna (BL), diepoksybutan (DEB)

• wykorzystwana jako marker do oceny sprawności mechanizmów reparacyjnych, biorących udział w usuwaniu zaburzeń struktury chromosomów

• jest cechą konstytutywną, modyfikującą indywidualną wrażliwość na działanie czynników rakotwórczych.

Testy pozwalające na wykrycie jawnych aberracji chromosomowych:

• test bleomycynowy

• test diepoksybutanowy

Test bleomycynowy - ocena niestabilności chromosomowej

• BL powoduje pęknięcia DNA( złamania chromosomów w fazie S-G₂ cyklu komórkowego)

• hodowla 72h, w 68h dodać 30miliu/ml BL

• ukrytą niestabilność chromosomową w tym teście ocenia się na podstawie

• średniej liczby złamań chromatyd w przeliczeniu na jedną komórkę (tzw. wskaźnik b/c; ang. breaks per cell)

• procentu metafaz z jednym bądź większą liczbą złamań chromosomów (am%; ang. percentage of aberrant metaphases)

• wskaźnik b/c:

• <0,8 - stabilność chromosomowa;

• 0,8-1,0 - niestabilność chromosomowa;

• ≥1,0 - podwyższona niestabilność chromosomowa

• bardziej restrykcyjne, podwójne kryterium, uwzględniają oba oceniane parametry (b/c>1 i am%>45)

• wrażliwość na BL jest cechą konstytutywną komórek i nie podlega wpływom czynników egzogennych

• nie można jednak stosować dla prognozowania zwiększonej indywidualnej, osobniczej podatności na wystąpienie choroby nowotworowej

• można jedynie stosować dla charakterystyki genetycznej grup pacjentów, gdyż zwiększona niestabilność chromosomów jest obserwowana u około 16% populacji ludzi zdrowych

Test diepoksybutanowy

• DEB indukuje efektywnie dwa niezależne zjawiska: aberracje chromosomowe i wymiany siostrzanych chromatyd.

• hodowla 72 h, w 24 h dodać 0.1 μg/ml DEB

• wykorzystuje się w diagnostyce anemii Fanconiego (FA)

• diagnostyka polega na obserwacji w preparatach barwionych barwnikiem Giemsy

• procentu uszkodzonych komórek (%am),

• liczby złamań na komórkę (b/c)

• procentu figur radialnych

• U chorych z FA obserwuje się

• %am > 80%

• b/c> 5.6

• figury radialne stanowią 30-100% obserwowanych aberracji

Anemia Fanconiego

• niedokrwistość hipoplastyczna postępująca miedzy 5 a 10 r.ż.

• wady wrodzone (szczególnie nieprawidłowości kości promieniowych)

• niski wzrost

• nadwrażliwość DNA na związki chemiczne tworzące wiązania krzyżowe z DNA - mitomycyna C

• wzmożona łamliwość chromosomów in vitro pod wpływem DEB

• zwiększenie ryzyka wystąpienia ostrej białaczki limfoblastycznej (5-10%), raka wątroby i raków płaskonabłonkowych

• średnia długość życia 16 lat

• dziedziczenie autosomalne recesywne z genetyczną heterogennością (co najmniej 7 grup genów)

• Dawka DEB (diepoksybutan)- 0,1 ug/ml

• Dodany po 24 godzinach hodowli na 48 godzin

Kryterium	Anemia Fanconiego
liczonych komórek	100
% uszkodzonych komórek (am%)	>80%
liczba złamań na komórkę (b/c)	>5,6
liczba aberracji na uszkodzoną komórkę	więcej niż jedna komórka ma więcej niż 10 złamań
% figur radialnych	30-100%

hot spots - miejsca w genomie szczególnie wrażliwe na złamania

SCE = wymiana chromatyd siostrzanych (ang. sister chromatid exchange)

• normalny proces podczas mitozy

• norma ≤ 10

• u chorych >100 / metafazę

• tworzenie czteroramiennych konfiguracji przez pary chromosomów homologicznych, które ulegają somatycznej rekombinacji

Barwienie SCE -różnicowe barwienie siostrzanych chromatyd

• pozwala na odróżnienie 2 siostrzanych chromatyd chromosomów i określenie częstości wymian miedzy nimi

• służy do oceny narażenia na czynniki mutagenne oraz łamliwości chromosomów w wrodzonych zespołach niestabilności chromosomów, np. Zespół Bloom'a

Zespół Bloom'a

• 15q26.1 - gen BLM - DNA-zależna ATPaza - replikacja i naprawa

• mała masa urodzeniowa, niski wzrost

• wrażliwy na światło rumień twarzy

• 10x wzrost SCE

• zwiększenie ryzyka wystąpienia nowotworu (ok.. 20%)

• dziedziczenie autosomalne recesywne

• Żydzi Aszkenazyjscy

MN - mikrojądra

• fragmenty chromosomów lub całe chromosomy nieprawidłowo rozdzielone podczas podziału komórkowego.

• kawałki chromatyny, odłamane, bez centromeru, do którego nie przyczepia się wrzeciono podziałowe

• dryfuą sobie i po podziale wytwarzją wokół siebie otoczkę

• są markerem zaburzeń w procesie naprawy uszkodzeń DNA

Test mikrojądrowy (MN)

• stosowany jest do

• oceny stopnia uszkodzeń chromosomów na poziomie pojedynczej komórki.

• wpływu środowiskowych i genetycznych czynników, oraz stylu życia na stabilność genetyczną

• polega na określeniu częstości występowania w komórce mikrojąder

• im więcej mikrojader tym więcej uszkodzeń

• łatwa do zastosowania w ludzkich limfocytach

Mostki nukleoplazmatyczne

• są obserwowane w niektórych dwujądrowych komórkach a wynikają z ekspozycji na promieniowanie jonizujące lub wolne rodniki.

• to ciągłe połączenia między jądrami, których szerokość może być zmienna, lecz zwykle nie przewyższa 1/4 średnicy jądra komórkowego.

• często komórki z mostkami nukleoplazmatycznymi  posiadają więcej niż jedno mikrojądro.

Comet Assay

• wykrywa złamania pojedynczej i podwójnej nici DNA in situ na poziomie komóki

• bardzo czuła metoda

• is relevant for the characterization of apoptotic cells.

• elektroforeza na szkiełku

• fluorescencyjne barwniki

• DNA cale:

• DNA popękane:

• im bardziej sie rozlewa tym bardziej popekane jest DNA

Analiza chromosomów barwionych technikami prążkowymi pozwala na zlokalizowanie punktów złamań chromosomów, wykrycie translokacji wzajemnych i inwersji.

METODY BARWIEŃ CHROMOSOMÓW

barwienie GTG (ang. G-bands by trypsin using Giemsa),

• prowadzi do

• uwidocznienia na chromosomach obrazu prążkowego odzwierciedlającego ich strukturalne i funkcjonalne zróżnicowanie.

• zlokalizowania punktów złamań chromosomów,

• wykrycia translokacji wzajemnych i inwersji

• wzór prążków G -unikatowy dla każdej pary chromosomów

prążki ciemno wybarwione odpowiadają regionom zawierającym nieliczne aktywne geny (zawierają LINES),dużo A-T ,późno replikujące się DNA, bogate w białka zawierające mostki siarczkowe(S-S)niehistonowe,nieaktywna genetycznie, skondensowana heterochromatyna

• prążki jasne R charakterystyczne sa dla regionów aktywnych genów, (80% zawierają SINES), dużo G-C, wcześnie replikujące się DNA, aktywna transkrypcyjnie, rozluźniona euchromatyna

• odczynniki: enzymy proteolityczne,np. trypsyna- denaturuje białka chromosomów

odczynnik Giemzy

barwienie QFQ (ang.Q-bands by fluorescence using quinacrine)

• prowadzi do

• uwidocznienia wszystkich chromosomów,

• satelity i centromery akrocentryków,

• wariantów morfologicznych chromosomu Y.

• badanie w świetle ultrafioletowym

• silnie fluoryzujące prażki: bogate w A-T (w większości odpowiadają prążka G)

okolice centromeru chromosomu 3, satelity chromosomów akrocentrycznych

dystalne odcinki ramion długich chromosomu Y

• prążki zmienne- brak podobieństwa miedzy prazkami Q i G

• odczynniki:

• fluorochromy mające zdolność jonowego wiązania się z DNA i zdolność do interkalacji miedzy płaszczyznę jego zasad, np. oranż akrydynowy

• fluorochromy interkalujące do podwójnego łańcucha DNAi wykazujące powinowactwo do pewnych zasad,np. atebryna(Q),iperyt akrychinowy(QM)

barwienie QFH - flourochrom : Hoechst 32258

barwienie RHG (ang. R-bands by heating using Giemza) - odwrotne prążkowanie do G

• prowadzi do

• uwidocznienia wszystkich chromosomów i aberracji

• aberracji w dystalnych regionach

• ciemne prążki: bogate w G-C

• chromosomy sa najpierw poddawane wysokiej temperaturze

• odczynniki: odczynnik Giemzy

barwienie RBG (ang. R-bands by BrdU using Giemza)

• prowadzi do

• uwidocznienia wszystkich chromosomów i aberracji

• uwidocznienia aberracji w regionach dystalnych

• uzupełnia analizę kariotypu przez ujawnienie drobnych aberracji regionie

telomerowym niewidocznych w G lub Q

• odczynniki: BrdU (5-bromodeoksyurydyna) wbudowywana w końcowej fazie syntezy DNA, odczynnik Giemzy

barwienie RBA (ang. R-bands by BrdU using )

• umożliwia wykazanie późnej replikacji nieaktywnego chromosomu X

• odczynniki : BrdU (5-bromodeoksyurydyna),

oranż akrydynowy

barwienie RFA (ang. R-bands by fluorescence using )

• umożliwia

• uwidocznienia wszystkich chromosomów

• barwienie odwrotne od G

• odczynniki : oranż akrydynowy

barwienie CBG (ang.C-bands by barium hydroxide using Giemsa)

• stosowane w przypadkach, kiedy konieczna jest dokładna ocean okolicy centromerów ( np. podejrzenie inwersji okołocentromerowej lub polimorfizmu centromerów)

• prowadzi do wykrycia

• chromosomów di-, czy też policentrycznych

• wariantów morfologicznych heterochromatyny konstytutywnej chromosomów 1,9,16,qY

• akrocentryków

• wielkość przewężeń wtórnych chromosomów par 1,9,16,qY -cecha polimorficzna

• prążki ciemne C: tandemowo powtarzające się sekwencje satelitarnego DNA,

związanego silnie ze specyficznymi białkami niehistonowymi, które chronią DNA,

• odczynniki: wodorotlenek baru Ba(OH)2 - inkubacja

odczynnik Giemzy - wybarwia heterochromatynę centromerową i

przycentromerową (przewężenia wtórne)

barwienie NOR (ang. Nuclear Organizer Regions)

• służy do

• uwidocznienia obszarów jąderek tworzących ramiona p akrocentryków

• badania polimorfizmu nitek satelitonośnych i satelitów

• badania aberracji ramion p chromosomów akrocentrycznych

• identyfikacji chromosomów markerowych, często utworzonych z ramion p chromosomów akrocentrycznych

• wybarwienie organizatorów jaderkotwórczych chromosomów 13-15, 21,22 (geny rybosomalne dla 18S,28S rRNA ; aktywna transkrypcja rRNA)

• odczynniki: AgNO3 (azotan srebra)

barwienie distamycyną A/DAPI

• zastosowanie:

• identyfikacja heterochromatyna okołocentromerowej chromosomów 1,9,16,qY,p15

• identyfikacja chromosomów markerowych z chromosomu 15

• wzór prążkowy podobny do Q

• silnie fluoryzujące prążki: heterochromatyna konstytutywna chromosomów 1,9,16,qY,p15

• odczynniki: distamycyna A -antybiotyk,który ma powinowactwo do par zasad A-T

DAPI (4,6-dwuamino-2-fenyloindol)- fluorochrom wykazujący

powinowactwo do par zasad A-T

Zastosowanie tych technik często jest jednak ograniczone trudnościami w uzyskaniu odpowiedniej liczby metafaz wysokiej jakości, umożliwiającej dokładną ocenę chromosomów.

TECHNIKI CYTOGENETYKI MOLEKULARNEJ

-umożliwiają detekcję i ocenę aberracji chromosomowych nawet bez konieczności izolacji chromosomów.

FISH = fluorescencyjna hybrydyzacja in situ

• pozwala na

• precyzyjną lokalizację punktów złamań w chromosomach

• badanie fuzji genowych (np. białaczki)

• określanie pochodzenia chromosomów markerowych

• badanie mikrodelecji, translokacji, addycji chromosomowych

• określanie pochodzenia centromerów

• badanie obecności telomerów

• badanie amplifikacji genów

• mozaicyzm

• kariotypowanie

• nie ma zastosowania do genów fuzyjnych nie prowadzacych ani do naddatku ani do ubytków chromosomów

• polega na wykrywaniu określonych sekwencji w chromosomach i/lub jądrach interfazalnych utrwalonych w preparacie cytogenetycznym z wykorzystaniem reakcji hybrydyzacji (tworzenia dwuniciowych kompleksów, przez jednoniciowe fragmenty DNA) sond molekularnych z komplementarnym (homologicznym) do nich odcinkiem zdenaturowanego DNA chromosomowego.

• sondy molekularne są znakowane fluorescencyjnie, co umożliwia detekcję w badanym preparacie

• można zastosować do badań komórek pochodzących ze świeżej tkanki, po hodowli, a także z preparatów utrwalonych w parafinie

FISH - SKY (ang. spectral karyotyping) oraz mFISH (ang. multicolor FISH),

• pozwalaja na pełną analizę kariotypu

• stosuje się głównie do wykrywania translokacji.

• potwierdzają diagnozę cytogenetyczną

• za ich pomocą których można wszystkie chromosomy wybarwić na różne kolory

COD-FISH (ang. Chromosome Orientation and Direction - FISH).

• umożliwia zaobserwowanie aberracji zrównoważonych - inwersji

• pozwala na określenie kierunku sekwencji badanego DNA, a co za tym idzie, obserwację odwrócenia sekwencji o 180° w przypadku inwersji

DI = indeks DNA

• do badania ploidii metodami cytometrycznymi

• parametr opisujący analizowane DNA

• wyliczany jako stosunek modalnej zawartości DNA w populacji badanej do zawartość DNA w komórkach prawidłowych danego gatunku.

• koreluje z liczbą chromosomów oznaczanych za pomocą analizy kariotypu

• DI = 1 próbki o zawartości DNA identycznej z komórkami prawidłowymi (diploidalne)

• populacje, których DI jest różny od stwierdzanego w komórkach prawidłowych określane są mianem aneuploidalnych,

• DI < 1 - hypodiploidalnych

• 2> DI > 1 - hypotetraploidalnych

• DI = 2 - tetraploidalnych.

• DI proliferującej populacji aneuploidalnych komórek nowotworowych wzrasta z każdym kolejnym podziałem komórki osiągając stan równowagi pomiędzy 1,5 a 2.

CGH = genomowa komparatywna hybrydyzacja (ang. comparative genomic hybridisation)

• pozwala na wykrycie naddatków lub ubytków materiału genetycznego w badanym DNA nowotworowym

• polega na hybrydyzacji znakowanego fluorescencyjnie genomowego DNA nowotworowego oraz DNA prawidłowego do prawidłowych chromosomów metafazalnych.

• porównanie emisji fluorescencji z tych dwóch rodzajów DNA wyznakowanych różnymi fluorochromami po reakcji hybrydyzacji

• iloraz sygnałów fluorescencyjnych= fluoresceina(DNA badane)/rodamina(DNA referencyjne)

• wykorzystywany jest DNA wyizolowany z komórek nowotworowych

• brak hodowli

• badanie genomu z dokładnością 5mega par zasad

DNA guza

XY

DNA prawidłowe

XX

NICPK transkrypcja

-malowanie i ciecie na odcinki

300- 600 par zasad

DNA DNA

prawidłowe metafazy XY- podkład

denaturacja i hybrydyzacja

(2 dni)

czerwono -zielony

nadmiar czerwonego - delecja

nadmiar zielonego- naddatek (amplifikacja)

FACS = cytometria przepływowa

• metoda z wyboru do rutynowego poszukiwania aneuploidii.

• pozwala ona na jakościową i ilościową ocenę populacji komórek badanych.

• wadą tej metody jest jej ograniczona czułość, związana z rozdzielczością aparatu - mianowicie, DI = 0,05 odpowiada 1 chromosomowi, podczas gdy w tej metodzie różnicująca zawartość DNA wynosi co najmniej 0,10 DI.

• w przypadku zmian mniejszych ilościowo (monosomia, trisomia itp.), korzystniej jest posłużyć się cytometria obrazową lub badaniami cytogenetycznymi, opisanymi powyżej.