Reakcja łańcuchowa polimerazy, PCR (ang. Polymerase Chain Reaction) - łańcuchowa reakcja polimeryzacji, metoda powielania łańcuchów DNA w warunkach laboratoryjnych, polegająca na sekwencji wielokrotnego podgrzewania i oziębiania próbki.
Do reakcji wprowadza się matrycowy DNA, trifosforany deoksyrybonukleotydów, startery oraz termostabilną polimerazę (może nią być na przykład polimeraza Taq wyizolowana z bakterii Thermus aquaticus lub polimeraza Pfu z bakterii Pyrococcus furiosis. Polimeraza Pfu charakteryzuje się większą progresywnością niż Taq, jednakże działa wolniej. Dostępne są także inne polimerazy, będące z reguły modyfikacjami wyżej wymienionych).
Fragment DNA ogranicza się z dwóch stron dwoma oligonukleotydowymi starterami komplementarnymi do przeciwległej nici DNA.
a) denaturacja termiczna nici DNA temperaturze przyłączenie startrów - w wyższej temperaturze (zwykle około 95°C) pękają wiązania wodorowe i podwójna helisa DNA rozdziela się na dwa pojedyncze łańcuchy.
b) amplifikacja przy udziale polimerazy oraz dezoksyrybonukleotydów, odbywa się w temperaturze niższej, ściśle określonej dla danej pary starterów (pomiędzy 45-70°C), umożliwiającej przyłączenie się ich do matrycy.
c) podwyższenie temperatury do około 72°C powoduje utworzenie się na matrycy, z przyłączonymi do niej starterami, kompleksu z polimerazą DNA, wskutek czego rozpoczyna się synteza nici komplementarnej do matrycy.
Kolejne podwyższenie temperatury zatrzymuje reakcję, a ochłodzenie, znów do 72°C rozpoczyna ją na nowo.
Gdyby wydajność metody była stuprocentowa, po n cyklach reakcji z jednej cząsteczki można by uzyskać 2n cząsteczek. W praktyce wydajność jest mniejsza.
Czas trwania badania to około 2-3 godziny, w ciągu których odbywa się 20-30 rund. DNA zostaje powielone standardowo około 105 razy. Powielone fragmenty trawi się odpowiednim enzymem restrykcyjnym, fragmenty uzyskane w wyniku trawienia rozdziela się elektroforezą żelową i uwidacznia w UV po zabarwieniu bromkiem etydyny.
Zalety:
- szybkość (wyniki po około 1 dniu)
- czułość
- swoistość
- wystarczy 50 ng badanego DNA lub nawet pojedyncze komórki
Wady:
- największą jest znajomość sekwencji fragmentu, który chcemy powielać w celu syntezy starterowych oligonukleotydów
Zastosowanie:
- klonowaniu genów
- diagnostyce klinicznej
- identyfikacji osób zaginionych
- kryminalistyce
- pracach nad gatunkami, które wyginęły
- wykrywanie prątków atypowych w komórkach (a także innych drobnoustrojów)
- wykrywanie swoistych mutacji leżących u podłoża chorób (np. anemia sierpowatokrwinkowa)
- oznaczenie markerów DNA w badaniu sprzężeń
Stosuje się również modyfikacje metody PCR, chociażby RT-PCR (Reverse Transcription) modyfikacja polegająca na użyciu mRNA jako matrycy. Synteza DNA na matrycy mRNA odbywa się przy użyciu odwrotnej transkryptazy (RT). Metoda ta pozwala na amplifikację wyłącznie sekwencji zawartej w dojrzałym mRNA, a więc tylko egzonów. Powstały DNA określany jest jako cDNA - komplementarny DNA.