Ćwiczenie 1 (26.02.2010)

''Techniki izolacji kwasów nukleinowych"

Przygotowanie teoretyczne do ćwiczeń:

- budowa i funkcje kwasów nukleinowych;

- właściwości fizyko-chemiczne kwasów nukleinowych;

- techniki izolacji kwasów nukleinowych;

Głównym celem ćwiczeń będzie przeprowadzenie izolacji kwasów nukleinowych z materiałów biologicznych różnego pochodzenia i różnym sposobie przechowywania. Izolacje przeprowadzone zostaną z zastosowaniem różnych znanych metod i wykorzystywanych powszechnie zestawów do izolacji. W końcowym etapie ćwiczeń zostaną przeprowadzone pomiary absorbancji (Nanodrop) i określone wydajności izolacji. Jakość wyizolowanych kwasów nukleinowych zostanie określona na Ćwiczeniach 2 (elektroforeza genomowego DNA/RNA i elektroforeza pulsacyjna, pokazujące stopień uszkodzenia i degradację kwasów nukleinowych).

Materiały:

- osady komórkowe (zawieszone w buforze 1 x PBS) linii nowotworowych K562, HCT116 p53+/+ i HCT116p53-/-;

- wątroba szczurza mrożona i utrwalona w 4% formalinie;

- miesień szkieletowy szczurzy mrożony;

- zestawy do izolacji DNA/RNA formy A&A Biotechnology i Fermentas;

- odczynniki do przeprowadzenia izolacji DNA metodą z wykorzystaniem fenolu:chloroformu:alkoholu izoamylowego

Wykonanie:

1. Każda z sekcji (1:6 i 7:12) otrzyma jeden typ materiału, z którego przeprowadzi izolację kwasów nukleinowych wskazaną techniką:

- izolacja DNA z rożnych tkanek i komórek przy użyciu mieszaniny fnol:chloroform:alk.izoamylowy;

- izolacja DNA z różnych tkanek i komórek przy użyciu komercyjnych zestawów do izolacji (Fermentas, A&A Biotechnology);

- izolacja RNA przy użyciu komercyjnych zestawów do izolacji (A&A Biotechnology);

- izolacja RNA metoda Chomczyńskiego (teoretycznie).

2. Pomiar absorbancji wyizolowanych kwasów nukleinowych i porównanie wydajności izolacji.

3. Zaliczenie ćwiczeń na podstawie zbiorczego zestawienia porównawczego wydajności izolacji, dla różnych materiałów biologicznych i technik izolacji (w formie protokołu).

Podział sekcji /materiałów/technik izolacji:

Sekcja	Materiał	Protokół
1,7	osady komórkowe (K562 lub HCT 166)	A
2,8	osady komórkowe (K562 lub HCT 166)	B
3,9	homogenaty mrożonych mięśni somatycznych szczura	A
4,10	homogenaty mrożonych mięśni somatycznych szczura	B
5,11	homogenaty mrożonych wątrób szczurzych	A
6,12	homogenaty, utrwalonych w 4% formalinie, wątrób szczurzych	A

Protokół A (izolacja DNA)

Odczynniki:

• bufor B: Na₂EDTA (5mmol/l), deferoksamina (0,15 mmol/l),10 mmol/l Tris-HCl, pH=8.0;

• proteinaza K 20 mg/ml (Sigma);

• rybonukleaza A 10 mg/ml (Sigma);

• rybonukleaza T1 10 000 jednostek Kunitza/ml (Sigma);

• SDS 10 % (m/v)(Sigma);

• mieszanina fenol:chloroform:alkohol izoamylowy (25:24:1), doprowadzona do pH=8.0 buforem Tris-HCl (0,5 mol/l);

• mieszanina chloroform:alkohol izoamylowy (24:1);

• etanol 96 % (v/v), 70 % (v/v);

• roztwór soli fizjologicznej 1 x PBS (firmy PAA).

Wykonanie:

Zamrożone osady komórkowe lub zamrożone/utrwalone tkanki umieszczano w roztworze soli fizjologicznej 1 x PBS ręcznie rozdrabniano homogenizatorem tłokowym przez 2 minuty w temperaturze 0-2°C. Otrzymaną zawiesinę wirowano przez 20 minut przy 700 × g w temperaturze 4°C. Osad wstępnie oczyszczonych jąder komórkowych przemywano roztworem 1 x PBS i wirowano jak wyżej.

1. Osad jąder komórkowych zawiesić w ok. 600 µl buforu B, następnie dodać:

- 2 µl rybonukleazy A (do stężenia 0,5 mg/ml),

- 4 µl rybonukleazy T1 (do stężenia 100 jednostek Kunitza/ml);

- 15 µl 20% SDS (do stężenia 0,5 %)..

Mieszaninę inkubować 30 minut w temperaturze 37°C.

2. Następnie dodać proteinazę K (20 µl - prowadzący), inkubację prowadzić 30 min w 50°C.

3. Przeprowadzić odbiałczanie równą objętością, ok. 600 µl mieszaniny fenol:chloroform:alkohol izoamylowy.

4. Mocno wytrzasnąć i wirować 15 min przy max. Obrotach (4000 RCF).

5. Fazę wodną przenieść do nowej probówki i ponownie ekstrahować rowna objętością mieszaniny chloroform:alkohol izoamylowy. Wytrzasnąć i zwirować j/w.

6. Fazę wodną przenieść do nowej próbówki i wytrącić z niej DNA podwójną objętością zmrożonego etanolu dodawanego do stężenia końcowego ok. 70 % (całość nie powinna przekroczyć objętości 1,5 ml).

7. Wytrącony DNA przemyć świeżą porcją 70 % etanolu. Po osuszeniu osad rozpuścić w 20 μl wody dejonizowanej. Przechowywać w +4°C.

Protokół B (izolacja DNA)

Odczynniki:

• bufor Tris (10 mM TrisHCL pH 8.5);

• Proteinaza K (20mg/ml);

• Bufor do płukania A1;

• Bufor do lizy LT.

Wykonanie:

1. Zawiesiny komórkowe (<10⁶) lub homogenaty z tkanek zwirować 10 min przy 7000 RPM

2. Usunąć nadsącz, osady zawiesić w 100 μl buforu Tris (10 mM TrisHCL pH 8.5).

4. Dodać 200 μl buforu do lizy LT i 20 μl Proteinazy K (prowadzący).

5. Wytrząsać przez 20 s.

6. Inkubować w 37 °C przez 20 min.

7. Przenieść probówki do 70 °C, inkubować przez 5 min.

8. Wytrząsać przez 20 s.

9. Następnie wirować przez 2 min przy 10 000 - 14 000 RPM.

10. Przenieść nadsącz na złoże kolumny do izolacji.

11. Wirować przez 1 min przy 10 000 - 14 000 RPM.

12. Dodać na kolummnę 500 μl roztworu płuczącego A1.

13. Wirować 1 min przy 10 000 - 14 000 RPM (wylać zawartość dolnego zbiorniczka).

14. Dodać na kolumnę 400μl roztworu płuczącego A1.

15. Wirować 2 min przy 10 000 - 14 000 RPM (wylać zawartość dolnego zbiorniczka.

16. W celu odpłukania DNA ze złoża przenieść kolumnę do nowej probówki eppendorf (1.5 ml) i dodac na złoże 50 μl buforu Tris lub wody (podgrzanych wcześniej do 75 °C).

17. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 5 min.

18. Wirować przez 1 min przy 10 000 - 14 000 RPM.

19. Zebrany na dnie probówki roztwór DNA przechowywać w +4°C.