Izolacja kwasów nukleinowych:

parametry izolacji warunkujące 

zachowanie natywnej struktury DNA

Monika Surówka

Znanych jest wiele procedur izolacji DNA, w wyniku których 

otrzymuje się DNA biologicznie aktywny, chemicznie 
stabilny oraz wolny od RNA i białek. DNA w komórce 
występuje w postaci kompleksu nukleinowo- białkowego 
(DNP). Izolacja zmierza więc do rozerwania tego kompleksu 
i wyodrębnienia DNA w stanie możliwie niezmienionym. 
Jednak ze względu na wielkość i wrażliwość 
chromosomalnego DNA praktycznie niemożliwa jest jego 
izolacja w takim stanie. Część DNA ulega mechanicznym 
uszkodzeniom.

Opracowanie procedury izolacji DNA wymaga szerokiej wiedzy 

na temat jego chemicznej stabilności i warunków w jakich 
znajduje się w swoim naturalnym środowisku ( komórka).

Parametry warunkujące zachowanie 

natywnej struktury DNA podczas 

izolacji.

1. pH

  

pH ma  istotne znaczenie, jeśli chodzi o stabilność 

poszczególnych wiązań w cząsteczce DNA: 

 wiązania wodorowe pomiędzy komplementarnymi łańcuchami 

są stabilne w środowisku o pH = 4 - 10

 

wiązania fosfodiestrowe w szkielecie DNA są trwałe w zakresie 

pH= 

3-12

wiązania N- glikozydowe z zasadami purynowymi( adeniną i 

guaniną) ulegają hydrolizie przy pH<3

2. temperatura

• Istnieją znaczne różnice w stabilności termicznej wiązań 

wodorowych w podwójnej spirali, ale większość DNA ulega 
rozpleceniu w temperaturze 80- 90 C.

• Wiązania N- glikozydowe i fosfodiestrowe są trwałe do 100 

C

• enzymy specyficzne degradujące DNA( DNazy) ulegają 

zniszczeniu przy podgrzaniu już do 65 C, dlatego 
wyizolowanie i przechowywanie DNA jest stosunkowo 
proste, inaczej jest w przypadku RNA, gdzie rybonukleazy 
są niezwykle stabilne, nawet po całkowitej denaturacji 
mogą ponownie fałdować i nabyć aktywność

3. siła jonowa

• DNA jest bardziej trwały i rozpuszczalny w roztworach soli

• W stężeniu soli mniejszym niż 0,1 M osłabiają się wiązania 

wodorowe pomiędzy komplementarnymi łańcuchami

4. warunki komórkowe

• przed uwolnieniem DNA konieczne jest rozbicie ściany 

komórkowej i liza błon komórkowych; łatwość rozbicia ściany 

zależy od rodzaju organizmu, w niektórych przypadkach 

konieczne jest intensywne ucieranie lub działanie 

ultradźwiękami( np. komórki drożdży czy tytoniu), podczas 

gdy w innych (np. E. coli) możliwa jest enzymatyczna 

hydroliza ściany komórkowej

• w komórce występuje kilka enzymów, które hydrolizują DNA, 

najistotniejszymi z nich są deoksyrybonukleazy, które 

hydrolizują wiązania fosfodiestrowe

• natywny DNA występuje w komórkach w kompleksie z 

białkami( histony, helikazy, polimerazy i inne), bialka te 

muszą być oddzielone podczas ekstrakcji

• obecność reszt fosforanowych sprawia, że kwasy 

nukleinowe są jednorodne i silnie naładowane ujemnie, z 
tego względu preferują środowisko wodne, inne składniki 
komórki( białka, tłuszcze, węglowodany) zawierają zarówno 
elementy naładowane jak i nienaładowane, stąd ich 
preferencja do środowiska organicznego, wodnego lub 
strefy na ich granicy

• kwasy nukleinowe ze względu na obecność dużych atomów 

fosforu, są cząsteczkami o dość wysokiej gęstości, dlatego 
mogą być oczyszczane w gradiencie chlorku cezu

5. odporność mechaniczna 

DNA

• łagodne manipulowanie nie zawsze jest możliwe podczas 

izolacji DNA, ucieranie, wytrząsanie, mieszanie i inne 
czynności mechaniczne mogą spowodować rozszczepienie 
DNA, zwykle nie powoduje to zniszczenia drugorzędowej 
struktury DNA, ale zmniejsza długość cząsteczki – 
fragmentacja.

Pobieranie materiału 

biologicznego.

Przechowywanie i przewożenie 

próbek.

 Prawidłowe pobranie materiału biologicznego, izolacja 
DNA, charakterystyka i przechowywanie DNA stanowią 
jeden z najważniejszych etapów pracy z DNA. Szczególnie 
ważny jest etap izolacji DNA, który musi zapewnić wysoką 
jakość preparatu DNA, umożliwiającą wykonanie dalszych 
analiz.

Materiał biologiczny wykorzystywany do 

izolacji DNA

• w przypadku człowieka i zwierząt:
   -  pełna krew obwodowa
   - komórki nabłonka
   - hodowla fibroblastów
   - komórki płynu owodniowego, kosmówki
   - cebulki włosów

rzadziej stosowanym materiałem wyjściowym są :
    - plazmy krwi, nasienia
    - fragmenty tkanek pobranych metodą biopsji cienkoigłowej
    - szpik kostny
w przypadku materiału archiwalnego i wykopaliskowego 

wykorzystuje się czaszkę, kości i zęby

• w przypadku roślin do izolacji DNA wykorzystuje się 
    - liście
    - młode siewki

 

Izolacja DNA powinna być rozpoczęta zaraz po pobraniu materiału. 

Tkanki mogą być wprawdzie przechowywane w temp. +4 C przez 

kilka dni bez widocznej degradacji DNA, jednak wskazane jest aby 

materiał, który nie jest poddany izolacji w ciągu 48 godz. od 

pobrania, zamrozić i przechowywać w temp. -20 C lub – 80 C. 

Szczególną uwagę należy zwrócić na zabezpieczenie materiału w 

czasie przewożenia i przechowywania. Jest to bardzo ważne w 

badaniach, medyczno-sądowych, jak i pracach hodowlanych, 

ponieważ materiał badawczy jest wtedy unikatowy i najczęściej 

nie 

     można go ponownie uzyskać. 
Materiał do badań molekularnych można przechowywać
w 3 postaciach, jako:
       1. zamrożoną tkankę
       2. lizat umieszczony w buforze( bufor do lizy: 100mM
           Tris-HCL, 40 mM EDTA, 0,2% SDS, pH 8,0).
       3. wyizolowany preparat DNA

Literatura:

• L. 

Kłyszejko – Stefanowicz, Ćwiczenia z biochemii, 

Warszawa 1980, PWN

• A. Jerzmanowski, K. Staron, Podstawy inżynierii 

genetycznej,

    Warszawa 1979, WSiP
• R. Słomski, Analiza DNA- teoria i praktyka, Poznań 

2008

• T. Mazurczak, Genetyka medyczna, Warszawa 1998, 

Wydawnictwo Lekarskie PZWL