Izolacja_DNA_plazmidy__Genetyka__2013

Cz.2_ GENETYKA_Laboratorium_2013/14

1. IZOLACJA DNA PLAZMIDOWEGO BAKTERII

Opracowano szereg metod oczyszczania plazmidowego DNA bakterii, z których ka

da obejmuje

trzy etapy: - hodowl

bakterii (namna

anie plazmidów)

- liz

bakterii, (rozpuszczenie)

- oczyszczanie plazmidowego DNA.

Plazmidy izoluje si

najcz

ęś

ciej z hodowli płynnych, w których podło

e uzupełnione jest

odpowiednim antybiotykiem, którego gen oporno

ci znajduje si

na plazmidzie. We wszystkich

metodach izolacji plazmidowego DNA wykorzystuje si

dwie istotne ró

nice pomi

dzy DNA

genomowym a DNA plazmidowym bakterii: - DNA genomowy jest wielokrotnie wi

kszy od DNA

plazmidu, - podczas procedury izolacji DNA plazmidowego DNA genomowy zostaje trwale

zniszczony, podczas gdy DNA plazmidowy pozostaje w postaci form CCC (ang. covalently closed

circle).

Odwirowane komórki bakteryjne poddawane s

lizie. Bakterie ulegaj

lizie pod wpływem

detergentów (SDS, Sarkozyl, Triton X-100), rozpuszczalników organicznych, roztworów

alkalicznych (liza alkaliczna) lub wysokiej temperatury (liza termiczna). Stosowany mo

e by

równie

lizozym - enzym trawi

cian

komórkow

bakterii (nie działa w pH<8.0). W metodzie lizy

alkalicznej bufor o wysokim pH zawieraj

cy NaOH i SDS powoduje całkowit

liz

komórki jak

równie

denaturacj

genomowego DNA, natomiast plazmidowy DNA w formie CCC zostaje

zdenaturowany jedynie na niewielkich odcinkach. W przypadku otrzymywania plazmidowego DNA

metod

termiczn

, czynnikiem denaturuj

cym jest wysoka temperatura, w której DNA genomowy i

plazmidowy zachowuj

podobnie jak w wysokim pH.

Nast

pny etap oczyszczania DNA polega na oddzieleniu DNA od zwi

zanych z nim białek.

Zwykle stosuje si

do tego celu nasycony buforem roztwór fenolu lub jego mieszanin

chloroformem i alkoholem izoamylowym. Białka mo

na równie

usun

ąć

przez trawienie ich

proteinazami (zwykle proteinaz

K). Usuni

cie kwasu RNA przeprowadza si

enzymatycznie,

inkubuj

c próbki z RNaz

(woln

od DNazy), przez s

czenie molekularne lub wirowanie w

gradiencie g

sto

ci. W metodzie lizy alkalicznej, kiedy liniowe cz

steczki DNA ulegaj

denaturacji,

natomiast superzwini

te formy CCC plazmidu s

po denaturacji nadal splecione, neutralizacja pH

roztworami o wysokim st

ęż

eniu soli (np. octan amonu) prowadzi do renaturacji jedynie DNA

plazmidowego, podczas gdy DNA genomowy wraz z RNA i białkami wytr

ca si

w postaci

serowatego osadu. Z odbiałczonych próbek DNA wytr

cany jest alkoholem etylowym lub

izopropanolem w obecno

ci octanu potasowego, sodowego lub amonowego.

Wszystkie metody otrzymywania plazmidowego DNA, z wyj

tkiem lizy alkalicznej, wymagaj

oddzielenia tego DNA od DNA genomowego w gradiencie chlorku cezu w obecno

ci bromku

etydyny. Wykorzystuje si

tu fakt,

e bromek etydyny intensywniej interkaluje do zdenaturowanego

DNA genomowego ni

do DNA plazmidowego, powoduj

c cz

ęś

ciowe rozwini

cie helisy DNA i

wydłu

enie cz

steczki, co powoduje zmniejszenie jej g

sto

ci pławnej. Ró

nica w g

sto

pomi

dzy form

CCC a liniow

i kolist

OC (ang. open circle) wynosi około 0.04 g/ml i jest

wystarczaj

ca do oddzielenia superzwini

tego DNA podczas wirowania w gradiencie g

sto

chlorku cezu w obecno

ci bromku etydyny. Pasmo superzwini

tego DNA układa si

poni

ej pasma

utworzonego przez liniowe fragmenty chromosomowego DNA oraz formy liniowej i OC plazmidu.

steczki RNA maj

najwi

ksz

sto

ść

i zbieraj

na dnie probówki wirowniczej, za

białka

pozostaj

w górnej warstwie roztworu.

Oczyszczanie plazmidowego DNA przeprowadzi

na równie

metod

wirowania lizatów

komórkowych w gradiencie alkalicznej sacharozy (w

rodowisku alkalicznym formy liniowe i OC

ulegaj

rozdzieleniu na pojedyncze nici i sedymentuj

3-4 razy wolniej ni

niezdenaturowana

superzwini

ta forma CCC), stosuj

c wymieniacze jonowe (np. kolumienki Qiagen) lub filtracj

elach.

PYTANIA

1. Jakie s

etapy izolacji plazmidowego DNA bakterii

2. Jakie s

ró

nice miedzy DNA genomowym a plazmidowym bakterii?

3. Jak usuwa si

białka, genomowe DNA i RNa z próby

4. Narysuj wynik wirowania gradiencie chlorku cezu w obecno

ci bromku etydyny w trakcie lizy

alkalicznej

ENZYMY RESTRYKCYJNE. MAPY RESTRYKCYJNE

Enzymy restrykcyjne (ang. restriction enzymes) s

enzymami izolowanymi z bakterii, zdolnymi do

rozpoznawania specyficznych sekwencji w DNA i przecinania dwuniciowej cz

steczki DNA. Enzymy

restrykcyjne typu II wymagaj

jako substratu dwuniciowej cz

steczki DNA, zawieraj

cej co najmniej

jedn

sekwencj

rozpoznawan

przez dany enzym, oraz jonów magnezu. DNA zostaje przeci

te w

obr

bie lub w okolicy palindromowej sekwencji rozpoznawanej. Sekwencja palindromowa w

genetyce oznacza tak

sekwencj

DNA, dla której sekwencja komplementarna jest identyczna (przy

zało

eniu,

e obie sekwencje czytamy z uwzgl

dnieniem polarno

ci nici; zgodnie z przyj

tym

obyczajem - od ko

ca 5' do 3'):

5' A A T T 3'
3' T T A A 5'

5' A G G C C T 3'
3' T C C G G A 5'

Niektóre enzymy produkuj

"lepkie ko

ce" 3'. Wszystkie natomiast pozostawiaj

grup

fosforanow

na ko

cu 5', a grup

hydroksylow

na ko

cu 3'. "Lepkie ko

ce" maj

e znaczenie przy

klonowaniu genów: sekwencje "lepkich ko

ców" powstałych w wyniku działania tego samego

enzymu s

komplementarne. W obecno

ci enzymu ligazy mo

na takie cz

steczki ponownie

poł

czy

ze sob

kowalencyjnie. Nazewnictwo enzymów restrykcyjnych opiera si

na literowych

skrótach, w których pierwsza litera pochodzi od rodzaju bakterii, a druga i trzecia od gatunku.

Nast

pna litera oznacza szczep lub typ, a kolejne enzymy z danego typu lub szczepu otrzymuj

liczby rzymskie.

Enzymy pochodz

ce z ró

nych szczepów, ale rozpoznaj

ce te same sekwencje DNA, nazywaj

izoschizomerami.

Zdarza si

e dwa enzymy wytwarzaj

takie same "lepkie ko

ce", mino

e rozpoznaj

ró

sekwencje DNA. Enzym BamHI produkuje ko

ce GATCC (rozpoznaje sekwencj

GGATCC), za

enzym Bgl II, wytwarzaj

cy takie same "lepkie ko

ce", rozpoznaje sekwencj

AGATCT. Umo

liwia

to klonowanie DNA strawionego BamHI w wektorze strawionym BglII, ale nie ka

dy sklonowany

odcinek DNA b

dzie mógł by

wycinany enzymem Bgl II.

Do pojedynczej reakcji trawienia u

ywa si

zwykle 0,2 - 1 ug DNA w roztworze o obj

ci 20 ul lub

mniejszej. Bufory do trawie

przygotowuje si

w postaci 10-krotnie st

ęż

onych roztworów ró

cych

dzy sob

zawarto

soli. Je

eli DNA ma by

strawiony dwoma enzymami wymagaj

cymi

ró

nych buforów, najpierw przeprowadza si

trawienie w buforze o ni

szej soli, a nast

pnie

podwy

sza si

ęż

enie soli w mieszaninie przez dodanie odpowiedniej obj

ci st

ęż

onego NaCl.

Inkubacj

preparatów DNA z enzymami restrykcyjnymi prowadzi si

w temperaturze 37

C w czasie

1 godziny lub dłu

ej. Przerwanie reakcji (zwykle niekonieczne) mo

na przeprowadzi

przez

termiczn

inaktywacj

enzymu (15 minut, 65

C) lub dodaj

c EDTA pH 8.0 do ko

cowego st

ęż

enia

10 mM (chelatacja jonów magnezu).

ródłem informacji o enzymach restrykcyjnych (ich

termostabilno

ci i wymaganiach co do st

ęż

enia soli) s

katalogi firm produkuj

cych te enzymy (np.

New England Biolabs, Promega). Jednostka enzymu restrykcyjnego to taka jego ilo

ść

, która trawi

kompletnie 1 ug DNA faga l (ok. 50 kb) w czasie 1 godziny w 37

Podstawow

cech

produktów trawienia DNA enzymami restrykcyjnymi jest to,

e otrzymywane

fragmenty DNA daj

rozdzieli

elach w taki sposób,

e w ka

dym pr

ąż

ku na

elu znajduj

steczki DNA o identycznej sekwencji nukleotydowej. Fakt ten pozwala na precyzyjn

obróbk

DNA, m.in. konstruowanie map restrykcyjnych badanego DNA (mapa restrykcyjna

wskazuje miejsca ci

te przez enzymy restrykcyjne). Analizuj

c na

elach produkty trawienia danego

DNA ró

nymi enzymami restrykcyjnymi, stosowanymi pojedynczo i w kombinacjach, mo

na ustali

wzajemne poło

enie i odległo

ci pomi

dzy sekwencjami rozpoznawanymi przez te enzymy. Oprócz

tego, DNA poci

ty enzymami restrykcyjnymi mo

na poddawa

ligacji z wektorem i tworzy

zrekombinowane (zawieraj

ce sklonowany DNA) plazmidy. Aby wyznaczy

wielko

ść

nieznanych

fragmentów DNA, stosuje si

standardy wielko

ci (cz

steczki DNA o znanej wielko

ci, poddawane

elektroforezie w tym samym

elu co cz

steczki badane).

PYTANIA

1. Narysuj wymy

lon

sekwencje DNA palindromowe i nie palindromowe

2. Czy ró

ne enzymy restrykcyjne mog

produkowa

takie same lepkie ko

3. Co oznacza jedna jednostka enzymu restrykcyjnego?
4. Czy w jednej reakcji mo

na u

ywa

cej ni

jednego enzymu

wiczenia praktyczne

1. Otrzymywanie DNA plazmidowego na mał

skal

(minilizaty) za pomoc

zastawu do

izolacji Plazmid Mini

Przed przyst

pieniem do

wicze

przeczytaj ze zrozumieniem cał

instrukcje do zestawu (plik

PDF).

Odczynniki i aparatura:

- pipety automatyczne i jednorazowe ko

cówki

- probówki szklane (10 ml) zawieraj

całonocna kultur

bakteryjn

(LB Amp+)

- woda
- probówki Eppendorfa,

- mikrowirówka,
- pisaki do probówek/ r

czniki

papierow/stojaki/alkohol do sterylizacji miejsca
pracy, r

kawiczki

Wykonanie: post

puj zgodnie z protokołem izolacji z uwzgl

dnieniem dwóch pierwszych kroków

(nie opisanych w protokole)

1. rozla

hodowle bakteryjn

do probówek Eppendorfa i zwirowa

bakterie w mikrowirówce przez 1

minut

(2 x 1.5 ml),

2. ods

czy

pipet

ywk

do sucha,

Podpisz swoje próby (tak

eby je rozpozna

do trawienia za tydzie

)

2. Trawienie plazmidu pRS 416 enzymami restrykcyjnymi i sporz

dzanie mapy restrykcyjnej

(planowanie na lab.II, przeprowadzanie reakcji na lab.III)

Odczynniki i aparatura:

Mapa plazmidu

- enzymy - dostepna z ZGE (ApaI; BamHI; Bsp68I (NruI); Bsu15I (ClaI); Eco147I (StuI);

Eco321 (EcoRV); EcoRI; HindIII; NcoI; NdeI; NotI; NsbI (MstI); PaeI (SphI); PvuI; PvuII;

SacI; Sali; ScaI; SmaI; SmiI (SwaI); XbaI; XhoI)

- bufory,

- katalogi enzymów restrykcyjnych (podane temperatury inkubaji, bufory i dezaktywacje)

1. Zaplanuj ciecie restrykcyjne wybranymi dwoma enzymami restrykcyjnymi pojedynczo i

oboma na raz.

2. Na podstawie katalogów dobierz bufory, temperatur

inkubacji i dezaktywacji.

Dostosuj do wybranych enzymów podany poni

ej typowy protokół:

Zmieszaj w eppendorfie w podanej kolejno

ci:

1µl 10x Buffer
6.5µl H2O
2µl DNA
0.5µl Enzyme
Inkubuj przez 1h w 37oC

3. Na postawie mapy oszacuj wielko

ść

powstałych po ci

ciu fragmentów plazmidu.

4. Narysuj jak b

dzie wygl

dał

el po elektroforezie

4. Eektroforeza agarozowa - sprawdzenie ci

cia restrykcyjnego (Lab.IV)

Odczynniki i aparatura:

- plazmid nie poci

- plazmid poci

- standard wielko

ci DNA,

- obci

ąż

nik do prób (niebieski)

- probówki Eppendorfa,
- aparat do elektroforezy (laboratoria 3)
Gotowy zel agarozowy zawieraj

cy barwnik

DNARed

- do strawionych próbek oraz do markera wielko

ci DNA doda

1/10 obj

ci barwnika do

elektroforezy,

- nanie

ść

próbki do studzienek na

elu przy pomocy pipety automatycznej (Uwaga! Minimalna ilo

ść

DNA, któr

wida

elu w postaci pr

ąż

ka, wynosi około 10 ng. Nie nale

y przekracza

200 ng

DNA w pr

ąż

ku),

- prowadzi

elektroforez

w buforze TBE przy napi

ciu nie przekraczaj

cym 5 V/cm,

- sfotografowa

el na transiluminatorze w

wietle UV,

- oszacowa

na podstawie krzywej wielko

ci trawionych fragmentów DNA i porówna

z planowan

przez siebie.

Przygotowanie dr Dominika Włoch-Salamon na podstawie: http://arete.ibb.waw.pl/docs/Skrypt-dla-fakultetu-99.html

RAPORT - nale

y odda

pod koniec zaj

ęć

(

eby prowadz

cy wiedział jakie enzymy

przygotowa

na kolejne zaj

cia)

Zaplanuj ciecie restrykcyjne wybranymi dwoma enzymami restrykcyjnymi pojedynczo i oboma na

raz. Na podstawie katalogów dobierz bufory, temperatur

inkubacji i dezaktywacji.

1. Wypisz dostosowany do wybranych enzymów podany poni

ej typowy protokół:

Zmieszaj w eppendorfie w podanej kolejno

ci:

1µl 10x Buffer
6.5µl H2O
2µl DNA
0.5µl Enzyme
Inkubuj przez 1h w 37oC

2. Podaj wielko

ci fragmentów DNA powstałych po ci

ciach zaplanowanych przez Ciebie

3. Narysuj jak b

dzie wygl

dał

el po elektroforezie