Ćwiczenia z inżynierii genetycznej

Sprawozdanie z ćwiczenia 1

Izolacja RNA całkowitego z krwi obwodowej .

Reakcja odwrotnej transkrypcji genów 18SRNA i BRCA1.

Wykonały:

Dominika Milczarek

Natalia Olszewska

Katarzyna Osmańska

Aleksandra Roman

Aleksandra Węcławska

1. Wstęp teoretyczny:

Budowa RNA

Struktura kwasu rybonukleinowego różni się od DNA. Jednostką cukrową w RNA jest ryboza. Kwas rybonukleinowy zbudowany jest z czterech rodzajów nukleozydów: adenozyny (AMP), guanozyny (GMP), cytydyny (CMP) oraz uracylu (UMP). Uracyl paruje komplementarnie z adeniną, tworząc dwa wiązania wodorowe, różniąc się od tyminy występowaniem grupy metylowej. Cząsteczki RNA występują w formie jedno- i dwuniciowej. Cząsteczki dwuniciowego RNA (dsRNA) nie mogą tworzyć tak regularnej struktury jak w przypadku B-DNA, ze względu na występowanie grupy hydroksylowej przy 2 atomie węgla rybozy. Zazwyczaj jednak RNA występuje w postaci jednoniciowego (ssRNA), silnie pofałdowanego polinukleotydu zawierającego odcinki dwuniciowe i tworzącego skomplikowane struktury przestrzenne.

Rodzaje RNA

Wyróżnia się kilka rodzajów RNA. DNA zawiera w sobie informację o każdym z rodzajów RNA (z pominięciem wirusów). W procesie transkrypcji (syntezy RNA) są tworzone prekursory poszczególnych klas RNA (preRNA), które ulegają później obróbkom potranskrypcyjnym. Istnieją trzy podstawowe grupy RNA - informacyjny RNA (mRNA), transportujący RNA (tRNA) oraz rybosomalny (rRNA), wszystkie wiążą się z procesem ekspresji informacji genetycznej.

a) mRNA - jest pojedynczą cząsteczką RNA (ssRNA), która jest nośnikiem informacji genetycznej, zawartej w postaci sekwencji zasad azotowych w cząsteczce. Na jej podstawie polimeryzowane są aminokwasy wg określonej kolejności - dzięki temu procesowi powstaje produkt końcowy ekspresji informacji genetycznej - białko.

b) tRNA - zwany transferowym RNA, służy do odczytywania kodu genetycznego i transportu odpowiednich aminokwasów do rybosomu, w trakcie procesu translacji. Cząsteczki tRNA zbudowane są z ok. 75 nukleotydów. W skład cząsteczki wchodzą również zmodyfikowane zasady azotowe (np.: dihydrourydyna, pseudourydyna). W każdej komórce znajduje się przynajmniej 20 rodzajów cząsteczek tRNA i przynajmniej jedna odpowiada swoistemu aminokwasowi. Cząsteczki tRNA posiadają cztery dwuniciowe obszary pozwalające wytworzyć drugorzędową strukturę podobną do liścia koniczyny.

c) rRNA - czyli rybosomalne RNA - to grupa kwasów rybonukleinowych wchodzących w skład rybosomu. Odkryto kilka klas rRNA, które w większości przypadków przyjmują złożoną strukturę drugorzędową łącząc się z polipeptydami wchodzącymi w skład poszczególnych podjednostek rybosomu. Przykładem może posłużyć 16S rRNA, które rozpoznaje miejsce "start" w cząsteczce mRNA, natomiast 23S rRNA oddziałuje z ramieniem akceptorowym cząsteczki tRNA.

d) inne rodzaje RNA - oprócz trzech podstawowych klas RNA można wspomnieć o istnieniu snRNA (ang. small nuclear RNA ) i scRNA (ang. small cytoplasmic RNA ) - małych cząsteczek rybonukleinowych, których długość nie przekracza 300 nukleotydów. Biorą one udział w procesach obróbki pierwotnego transkryptu takich jak splicing, czy poliadenylacja 3'końca.

Izolacja RNA

Izolację RNA przeprowadza się w podobny sposób jak izolację DNA. Ze względu na wszechobecność termostabilnych RNaz w tkankach, izolacja RNA wymaga większej staranności. Aby otrzymać niezdegradowany RNA wymagany jest czynnik inaktywujący RNazy np. DEPC (dietylopirowęglan). Dodaje się go do wszystkich odczynników. Ponadto szkło i sprzęt , który ma bezpośredni kontakt z preparatem musi być wysterylizowany w odpowiedni sposób. Powszechnie stosowaną metodą izolacji jest procedura Chomczynskiego polegająca na lizie komórek w roztworze rodanku guanidyny (inhibitor RNaz) i następnie ekstrakcji mieszaniną fenolu i chloroformu. Lekko kwaśny odczyn fenolu sprawia, że wytrąceniu oprócz białek ulega również DNA, który w tych warunkach jest praktycznie nierozpuszczalny.

Synteza I nici cDNA

Pierwsza nić cDNA jest syntetyzowana przez polimerazę DNA zależną od RNA, używającą jako szablonu poly(A)RNA lub mRNA. Dostępne są dwa enzymy:

Ptasia odwrotna transkryptaza, która została oczyszczona z cząsteczek ptasiego wirusa ALV. Zbudowana jest z dwóch nieidentycznych białkowych podjednostek, które wykazują kilka aktywności:

- syntezę DNA zależna od RNA (odwrotna transkrypcja)

- endonukleolityczne rozszczepienie DNA

- endonukleolityczna zdolność ataku na część RNA w hybrydzie DNA-RNA.

Jest to enzym wykorzystywany w celu konstruowania bibliotek cDNA. Wykazuje on aktywność RNazy Razy, co jest powodem zmniejszonej długości otrzymywanych transkryptów cDNA.

Mysia odwrotna transkryptaza, która została wyizolowana z genu mysiego wirusa Leukemii Moloneya (M--MLV). Zbudowana jest z pojedynczego polipeptydu, stanowiącego jedną podjednostkę, wykazującego aktywności:

- syntezy DNA zależnej od DNA i RNA,

- ograniczonego degradowania RNA w hybrydach DNA-RNA,

- brak aktywności endonukleaz.

Enzym ten wykorzystywany jest w przypadku konieczności uzyskania transkryptów o pełnej długości, dłuższych niż 2-3 kpz.

Synteza II nici cDNA

Reakcja z oligonukleotydami

Po syntezie pierwszej nici używa się terminalnej transferazy w celu dodania homopolimerowych końców reszt dC do wolnych grup 3'OH. Następnie ogony te są hybrydyzowane z oligo dG, które pełnią funkcję primerów dla syntezy II nici cDNA. Dzięki tej metodzie mogą zostać uzyskane klony o pełnej długości z dużą wydajnością.

Użycie fragmentu plazmidowego DNA, posiadającego krótki koniec dG reszt jako primer dla syntezy II nici. Reszty dG przyłączone są do homopolimerowego traktu reszt dC, który został dodany z końca 3' pierwszej nici cDNA przez terminalną transferazę.

Opracowano kilka modyfikacji metody, upraszczających procedurę poprzez ominięcie potrzeby ligacji linkierów upstream, które używane są jako primery w celu syntezy drugiej nici i w celu łączenia dwuniciowego cDNA w strukturę plazmidu. Objęły one:

- używanie syntetycznych primerów, które niosą oba homopolimerowe końce w celu promowania syntezy I oraz II nici cDNA.

- używanie liniowych plazmidów zawierających syntetyczne końce dT na jednym końcu 3' oraz syntetyczne dC końce na drugim. Koniec 3' posiada grupę fosforanową w celu zablokowania przyłączania kolejnych reszt z tego końca. Gdy końce dT zostaną użyte użyte w celu syntezy pierwszej nici cDNA reszty dG zostaną dodane do wolnego końca 3' przez terminalną transferazę. Blokada 3' końca jest usuwana przez alkaliczną fosfatazę i II nić jest syntetyzowana przy udziale Razy H, polimerazy DNA I, ligazy DNA.

Self-priming

Słabo kontrolowana reakcja, możliwa utrata lub zmiana sekwencji znajdujących się na końcu 5'mRNA. Metoda z wykorzystaniem polimerazy DNA I z E.coli oraz RNAzy H:

- reakcja prowadzona w pH=6,9 (minimalizacja 5'->3' aktywności egzonukleazy) i w 15^oC (minimalizacja syntezy snapback DNA). Problemy te można ominąć stosując odwrotną transkryptazę lub fragment Klenowa pozbawiony 5'->3' egzonukleazowej aktywności;

- do procesów włączana jest też czasem ligała DNA z E.coli (wzrost wydajności klonowania długich fragmentów fragmentów DNA)

- polimeraza DNA T4 lub termostabilna polimeraza Pfu dodawane są na końcu reakcji syntezy II nici w celu oczyszczania końca dwuniciowego transkryptu DNA.

Synteza II nici cDNA poprzez zamianę

Produkt syntezy I nici cDNA-hybryda cDNA:mRNA jest matrycą dla procesu nick-translacji. Aktywność RNAzy H powoduje powstanie nacięć w nici mRNA hybrydy cDNA:mRNA powodując powstanie kilku primerów, które używane są przez polimerazę DNA I z E.coli podczas syntezy II nici. Na ońu w celu wykończenia syntezy stosuje się polimerazę DNA T4.

2. Przebieg ćwiczenia:

Ćwiczenie laboratoryjne składa się z kilku etapów przeprowadzonych w ciągu trzech dni. Ćwiczenie wykonywano w grupie pięcioosobowej.

Wykonanie ćwiczenia:

IZOLACJA DNA CAŁKOWITEGO

1. Do 10 ml badanej próby dodajemy 5 ml TKM1 (DEPC) i 250 µl Trytonu X-100.

2. Otrzymany roztwór obracamy na rolerze przez 10 minut, a następnie wirujemy w 2200rcf przez 10 minut.

3. Supernatant wylewamy, a do osadu dodajemy 5 ml TKM1. Wytrząsamy i wirujemy w 2200rcf przez 10 minut. Czynność powtarzamy jeszcze raz.

4. Do osadu dodajemy 800 µl Fenzolu i mieszamy przez pipetowanie.

5. Inkubujemy przez 5 minut w temperaturze 50°C.

6. Dodajemy 200 µl chloroformu i intensywnie worteksujemy przez 15 sekund.

7. Inkubujemy w RT, a następnie wirujemy przez 10 minut przy 10-12 tys. RPM.

8. Przenosimy górną frakcję do nowej probówki i dodajemy 250 µl izopropanolu.

9. Mieszamy i nanosimy na minikolumnę. Wirujemy przez 1 minutę przy 10-12 tys. RPM.

10. Przenosimy kolumnę do nowej probówki o objętości 2 ml i dodajemy 700 µl roztworu A1. Wirujemy 1 minutę przy 10-12 tys. RPM.

11. Wyciągamy kolumnę z probówki, usuwamy przesącz i ponownie umieszczamy kolumnę w probówce. Dodajemy 700 µl roztworu A1. Wirujemy 2 minuty przy 10-12 tys. RPM.

12. Przenosimy kolumnę do nowej probówki 1,5 ml i dodajemy 200 µl roztworu A1. Wirujemy 2 minuty przy 10-12 tys. RPM.

13. Osuszamy kolumnę i umieszczamy ją w nowej probówce 1,5 ml. Dodajemy 100 µl jałowej wody, wolnej od RNAz.

14. Inkubujemy 3 minuty w RT, a następnie wirujemy 1 minutę przy 10-12 tys. RPM.

15. Usuwamy kolumnę, a RNA przechowujemy w zamrażarce do czasu dalszych analiz.

ELEKTROFORETYCZNA OCENA ILOŚCI WYIZOLOWANEGO RNA

1. Pobieramy 20 µl roztworu wyizolowanego RNA.

2. Dodajemy 1 µl 2M octanu sodu. Mieszamy, a następnie dodajemy 21 µl izopropanolu.

3. Worteksujemy i pozostawiamy w temperaturze -20°C na 1 godzinę (w tym czasie wykonujemy pomiar spektrofotometryczny).

4. Wirujemy przez 30 minut w 10000g i zlewamy supernatant.

5. Rozpuszczamy osad w 5 µl wody wolnej od RNAz.

6. Przygotowujemy 1% żel agarozowy przy użyciu buforu 1XTAE.

7. Przygotowujemy próbki do nałożenia na żel przez wymieszanie z 0,5 µl barwnika obciążającego.

8. Prowadzimy elektroforezę przy 80V przez 20 minut.

9. Wybarwiamy żel przez 15 minut w roztworze bromku etydyny.

10. Z uwagi na to, że nie dosuszyliśmy dostatecznie próbek przed rozpuszczeniem ich w wodzie wolnej od RNAz, część materiału wypłynęła z kieszonek. Elektroforezę przeprowadziliśmy jeszcze raz. Próbki przygotowaliśmy jeszcze raz według wcześniejszej procedury.

11. Parametry drugiej elektroforezy: 30 minut przy 70V.

12. Barwienie żelu: 15 minut w roztworze bromku etydyny.

SPEKTROFOTOMETRYCZNA OCENA ILOŚCI RNA

1. Przygotowujemy 100 µl 10X rozcieńczonego RNA otrzymanego z izolacji.

2. Mierzymy absorbancję roztworu przy 260/280 nm względem odpowiedniej próby referencyjnej.

3. Obliczamy stężenie RNA przyjmując, że 1 OD= 38 M RNA.

ODWROTNA TRANSKRYPCJA RNA

1. Przygotowujemy mieszaninę reakcyjną (przez cały czas pracujemy na lodzie):

• RNA - 0,1-5 µg

• primer o specyficznej sekwencji - 20 pmol na reakcję

• DEPC-H₂O - do 11 µl obj. końcowej

Delikatnie mieszamy, a następnie wirujemy 3-4 sekundy.

Inkubujemy mieszaninę w temperaturze 70°C przez 5 minut, a następnie przenosimy na lód.

Następnie kolejno dodajemy:

• Bufor reakcyjny (5x) - 4 µl

• Inhibitor rybonukleazy (40U/µl) - 0,5 µl

• Mieszanina DTP (10mM) - 2 µl

• Delikatnie mieszamy, a następnie wirujemy przez 3-4 sekundy.

• Inkubujemy mieszaninę w temperaturze 37°C przez 5 minut.

• Dodajemy 2 µl odwrotnej transkryptazy M-Mul1V (20U/µl).

Końcowa objętość mieszaniny reakcyjnej wynosi 20 µl.

8. Inkubujemy mieszaninę w temperaturze 37°C przez 60 minut.

9. Zatrzymujemy reakcję ogrzewając mieszaninę do 70°C przez 10 minut, a następnie przenosimy na lód.

REAKCJA PCR

1. Odmierzamy 10 µl cDNA do nowej probówki.

2. Przygotowujemy mieszaninę reakcyjną i dodajemy:

• Bufor PCR 10X - 10 µl

• Mieszaninę DTP - 8 µl

• Startery - po 2 µl 18SR, 18SF, BRCAR, BRCAF

• Polimeraza Taq DNA (5U/µl) - 0,5 µl

• MgCl₂ - 6 µl

Całkowita objętość końcowa - 100 µl.

3. Profil temperaturowy reakcji:

• 2 min. 95°C - wstępna denaturacja

• 30 s. 95°C - denaturacja

• 30 s. 50°C - przyłączanie starterów

• 30 s. 72°C - wydłużanie

• 5 min. 72°C - końcowe wydłużanie

Przeprowadzamy 30 cykli.

OCZYSZCZANIE PRODUKTU PCR

1. Do założonej kolumny pipetujemy 400 µl dH₂O, a następnie, nie dotykając końcówką membrany, nakładamy 100 µl produktu RT-PCR i szczelnie zamykamy probówkę.

2. Przeprowadzamy kolejne wirowania w następujących warunkach:

• 1000xg - 15 minuty

• 2200xg - 15 minut

• 5000xg - 3 minuty

• 5000xg - 3 minuty

• 8000xg - 3 minuty

• Kolumnę z osadem zachowujemy i nakładamy na nową probówkę.

• Nakładamy na kolumnę 20 µl dH₂O, a następnie ostrożnie obracamy ją do góry dnem i zatykamy w probówce.

• Wirujemy w 1000xg przez 2 minuty.

• Kolumnę odrzucamy. Oczyszczony produkt reakcji RT-PCR znajduje się na dnie probówki.

ELEKTROFOREZA PRÓB DNA Z REAKCJI RT- PCR W 1,5% ŻELU AGAROZOWYM

1. Przygotowujemy 50 ml roztworu 1,5% agarowy w buforze 1XTAE.

2. Agarozę rozpuszczamy przez ogrzewanie połączone z mieszaniem na ceramicznej płycie grzewczej mieszadła magnetycznego.

3. Czekamy, aż roztwór ostygnie do temperatury ok. 70°C.

4. Umieszczamy tackę na żel w aparacie do elektroforezy „Horizon 58” i blokujemy ją z dwóch stron wsuwając w wycięcia kliny. Wylewamy roztworem żelu na saneczki do formowania żelu i wkładamy grzebień.

5. Po zastygnięciu zalewamy żel buforem 1XTAE i wyjmujemy grzebień.

6. Przygotowujemy próbki mieszając 2,5 µl buforu obciążającego i 10 µl próbki DNA. Przygotowujemy wzorzec ilości DNA mieszając 2,5 µl buforu obciążającego i 10 µl roztworu DNA z linii K562 (Promesa) o stężeniu 10 ng/µl.

7. Nanosimy po 12 µl roztworu do kieszonek żelu.

8. Elektroforezę prowadzimy przez 30 minut przy napięciu 90 V.

9. Żel barwimy przez 10 minut w roztworze bromku etydyny.

3. Obliczenia

• Elektroforeza w żelu agarozowym w celu oceny wyizolowanego RNA

Przygotowano 50 ml 1% żelu agarozowego w buforze 1xTAE według następujących obliczeń

Objętość buforu:

1/50*50 ml= 1ml TAE

Masa agarozy:

1 g - 100 ml

x g - 50 ml

x = 1 g

• W trakcie przebiegu tego etapu ćwiczenia wykonano jeszcze jeden rozdział elektroforetyczny, ponieważ wyizolowane RNA zostało rozpuszczone przed osuszeniem go z etanolu.

W tym celu przygotowano 30 ml 1% żelu agarozowego w buforze 1xTAE

Objętość buforu:

1/50*30 ml= 0,6 ml TAE

Masa agarozy:

1 g - 100 ml

x g - 30 ml

x = 0,3 g

• Elektroforeza cDNA otrzymanego na drodze reakcji odwrotnej transkrypcji.

Przygotowano 50 ml 1,5% żelu agarozowego w buforze 1xTAE

Objętość buforu:

1/50*50 ml= 1ml TAE

Masa agarozy:

1,5 g - 100 ml

x g - 50 ml

x = 0,75 g

4. Wyniki i wnioski

Obraz rozdziału elektroforetycznego wyizolowanego RNA (bez wysuszenia go po wytraceniu etanolem).

Obraz rozdziału elektroforetycznego wyizolowanego RNA wysuszonego po wytraceniu etanolem.

Zaprezentowane powyżej wyniki rozdziału RNA w żelu w obu przypadkach są prawidłowe.

Analizowane przez grupe próbki (ścieżki 1 i 2 od lewej strony) przedstawiają dwa wyraźne prążki.

Prążki położone bliżej linii startu odpowiadają frakcji 28S RNA, zaś te dalej położone frakcji 18S RNA.

Wynik z pierwszego żelu jest czytelniejszy, dlatego można przypuszczać, że RNA zostało jednak widłowo osuszone po wytrącaniu etanolem.

Wynik z drugiego żelu jest mniej czytelny, prawdopodobnie dlatego, że próbka poddana ponownej analizie nie została prawidłowo zabezpieczona, w wyniku czego mogło dojść do jej zanieczyszczenia i częściowej degradacji RNA. Ponadto ze względu na ograniczony czas zajęć skrócono czas barwienia i wytrącania RNA.

Wyniki pomiaru spektrofotometrycznego wyizolowanego RNA.

Pomiar przy λ=260 nm	Pomiar przy λ=280 nm
1,273	0,702
1,265	0,698
1,256	0,694
Średnia wartość=1,26466	Średnia wartość=0,698

A₂₆₀/A₂₈₀=1,8

38 μg/ml - 1 OD

X (μg/ml) -1,2646

X=48,057 μg/ml

RNA rozcieńczono 10- krotnie, dlatego

48,057 μg/ml * 10 = 480,57 μg/ml

Przedstawione wyniki świadczą o prawidłowo przeprowadzonej izolacji RNA.

Otrzymane RNA ma wysokie stężęnie.

Niski stosunek absorpcji A₂₆₀ do A₂₈₀ mieści się w granicach normy 1,8 - 2,0, co potwierdza, że preparat został wystarczająco oczyszczony.

Obraz rozdziału elektroforetycznego cDNA otrzymanego w reakcji odwrotnej transkrypcji .

Ścieżka 3 - cDNA 18S RNA

Ścieżka 4 - II nić DNA 18S RNA

Ścieżka 5 - cDNA BRCA1

Ścieżka 6 - II nić DNA BRCA1

Reakcja odwrotnej transkrypcji została przeprowadzona prawidłowo. Świadczy o tym obraz prążków w żelu.

Niestety ze względu na zbyt długi czas rozdziału, DNA z lewej części żelu znalazło się w kieszonkach prawej części żelu. Kieszonki te wyraźnie świecą co oznacza, że znajduje się tam DNA wyznakowany bromkiem etydyny.

Prążki 28 S RNA

Prążki 18 S RNA

Prążki 18 S RNA

Prążki 28 S RNA

6

54

3

---