SPRAWOZDANIE

Ćwiczenie nr 3
„Kataliza enzymatyczna: oksydazy, katalaza, peroksydazy”

Data wykonania ćwiczenia: 03.11.2015 r.

Skład sekcji:
Czekaj Marta

Czemerajda Agata

Potrzebowska Natalia

Serafimowicz Weronika

1. PRZEBIEG ĆWICZENIA:

Przed przystąpieniem do ćwiczeń przygotowano wyciąg ziemniaczany będący wodnym ekstraktem enzymów i skrobii.

1. Wykrywanie oksydaz obecnych w ziemniakach:
   

• Do trzech probówek wprowadzono po 5 ml wyciągu ziemniaczanego

• Kolejno do każdej probówki dodano po 10 kropel:

1. 1% roztworu fenolu

2. 1% roztworu pirokatechinhy

3. 1% roztworu pirogallolu

• Zawartość probówek wymieszano i poddano obserwacji

1. Wykrywanie katalazy obecnej w ziemniakach:
   

• Przygotowano dwie probówki zawierające po 5 ml wyciągu ziemnaczanego

• Pierwszą probówkę poddano ogrzewaniu w łaźni wodnej a następnie wprowadzono do niej 1 ml nadtlenku wodoru

• Do drugiej probówki H₂O₂ dodano bez uprzedniego ogrzewania

• Obserwacje zanotowano

1. Wykrywanie peroksydaz obecnych w ziemniakach – próba z fenolami:
   

• Do sześciu probówek wprowadzono po 5 ml ekstraktu

• Trzy z nich poddano ogrzewaniu w łaźni wodnej

• Kolejno do każdej probówki dodano po 10 kropel:

1. 1% roztworu fenolu

2. 1% roztworu pirokatechinhy

3. 1% roztworu pirogallolu

• Następnie do wszystkich probówek wprowadzono 10 kropli H₂O₂

• Zawartość probówek wymieszano i poddano obserwacji

1. OBSERWACJE I WYNIKI
   

1. Oksydazy – zmiana intensywności barwy wraz z upływem czasu.
   
   

Próba	Obserwacje
	0 min.
Fenol	Brak zmiany zabarwienia
Pirokatechina	Pomarańczowy
Pirogallol	Jasno żółty

1. Katalaza
   
   

Próba	Obserwacje
Probówka ogrzewna	Denaturacja białka
Probówka nieogrzewana	Intensywne wydzielanie pęcherzyków gazu, jasno pomarańczowe zabarwienie

1. Peroksydazy
   
   

Próba	Obserwacje
	Ogrzewanie
Fenol + H2O2	Brak zmiany zabarwienia, kłaczki zdenaturowanego białka
Pirokatechina + H2O2	Jasno różowy, kłaczki zdenaturowanego białka
Pirogallol + H2O2	Jasno żółty, kłaczki zdenaturowanego białka

1. WNIOSKI

1. Oksydazy:

Oksydazy przenoszą wodór bezpośrednio na tlen atmosferyczny. W wyniku działania enzymu polifenole przekształcane są w o-chinon, który następnie ulega dlaszej kondensacji, której efektem są produkty o ciemnym zabarwieniu. W przypadku monofenolu jest on najpierw przeształcany do pirokatehiny, dzięki czemu może ulegać dlaszym reakcjom.

W przypadku wyciągu ziemniaczanego fenol prawdopodobnie nie uległ przekształceniu do katecholu (bądź aktywność oksydazy została całkowice wykorzystana tylko do jego przekształcenia w pirokatechinę, bez utlenienia
do form chinonowych), o czym świadczy znikoma zmiana barwy próby.

Najsilniejszemu utlenieniu uległa próba z dodatkiem fenolu dwuwodorotlenowego.

1. Katalaza:

Katalaza jest to enzym katalizujący rakcję rozkładu nadtlenku wodoru do tlenu
i wody.

2H₂O₂→2H₂O+O₂ 

W przypadku próby ogrzewanej nastąpiła całkowita dezaktywacja enzymu
z powodu jego denaturacji, w związku z czym nie zaobserwowano wydzielania pęcherzyków gazu. Przeciwne rezultaty otrzymano w przypadku próby nieogrzewanej, gdzie wydzielanie tlenu odbyło się w sposób intensywny
i gwałtowny.

1. Peroksydazy:

Peroksydazy są enzymami wykorzystującymi nadtlenek wodoru w reakcjach utleniania różnych substratów.

AH₂+H₂O₂→A + 2H₂O

Zmina zabarwienia produktów nastąpiła znacznie szybciej niż w przypadku próby z samą oksydazą, ponieważ po dodaniu nadtlenku wodoru aktywne stały się również peroksydazy.

W przypadku uprzedniego ogrzewania wyciągów ziemniaczanych zaobserwowano delikatne zmiany zabarwienia prób z dodatkiem pirokatechiny oraz pirogallolu, co świadczy o tym, że peroksydazy zachowują częściową aktywność enzymatyczną w podwyższonej temperaturze. W roztworze z dodatkiem fenolu zmiany koloru nie zanotowano, co wskazuje na trudności peroksydaz w utlenianiu fenoli jednowodorotlenowych.

W probówkach nieogrzewanych nastąpiła intensywna zmiana zabarwienia w wyniku równoczesnego działania peroksydaz oraz oksydaz. Również w próbie z fenolem zaobserwowano zmianę koloru na czerwony, co znaczy, że został on częciowo przekształcony przez oksydazy w formy dwuwodorotlenowe, a następnie utleniony przez peroksydazy.