LABORATORIUM Z BIOFIZYKI

Biotechnologia

Ćwiczenie 7

Wyznaczanie krytycznego stężenia tworzenia miceli niejonowego detergentu metodą fluorescencyjną.

Data wykonania zadania: 14.12.2011

Data oddania sprawozdania: 21.12.2011

Ćwiczenie wykonali:

…………………………………………….........

…………………………………………….........

…………………………………………….........

…………………………………………….........

…………………………………………….........

…………………………………………….........

Wstęp

Celem ćwiczenia było wyznaczenie krytycznego stężenia tworzenia miceli niejonowego środka powierzchniowo czynnego metodą fluorescencyjną oraz określenie wpływu innych substancji na wartość CMC.

Środki powierzchniowo czynne, czyli detergenty to związki, których cząsteczki zbudowane są z długiego niepolarnego łańcucha alifatycznego i końcowej grupy polarnej o charakterze jonowym lub niejonowym. Obniżają one napięcie powierzchniowe wody, ponieważ gromadzą się na jej powierzchni, niepolarne ogony mają skierowane na zewnątrz, a polarne grupy do wnętrza. Przykładem takiego związku jest Triton-X 100, który jest niejonowym surfaktantem otrzymanym w wyniku polimeryzacji tlenku etylenu, a następnie przyłączenia do niego alkoholu.

W rozpuszczalnikach polarnych, których cząsteczki tworzą co najmniej dwa wiązania wodorowe detergenty skupiają się w agregaty, zwane micelami, będące kulistymi tworami, gdzie łańcuchy alifatyczne splątane są razem i skierowane do wewnątrz i tworzą hydrofobowe wnętrze, a polarne grupy skierowane są na zewnątrz tworząc polarną powierzchnię.

CMC, czyli krytyczne stężenie tworzenia miceli jest stężeniem środka powierzchniowo czynnego, poniżej którego roztwór zachowuje się jak zwykły roztwór, a powyżej którego zaczynają tworzyć się micele, a właściwości roztworu znacząco się zmieniają (napięcie powierzchniowe, wielkości koligatywne, przewodnictwo, rozpraszanie światła). Wielkość CMC różnych surfaktantów zależy od temperatury, dodatku elektrolitów i różnych związków organicznych.

Metoda wyznaczania CMC opiera się na pomiarze fluorescencji związku, którego wydajność świecenia zależy od polarności otoczenia. Fluorescencja jest przykładem fotoluminescencji, czyli promieniowania emitowanego przez atomy lub cząsteczki powracające do stanu podstawowego z elektronowego stanu wzbudzonego. Powstaje dzięki przejściom między stanami elektronowymi o jednakowej krotności (S₁→S₀). Przykładem takiego związku może być kwas 1, 8 – anilinosulfonowy (ANS). Innym przykładem fotoluminescencji jest fosforescencja, czyli emisja kwantu świetlnego przy przejściu atomu lub cząsteczki między stanami o różnej krotności (ze stanu trypletowego na singletowy T₁→S₀).

Pomiary polegały na mierzeniu fluorescencji (przy długości fali λ=490 nm) roztworów o różnym stężeniu Tritonu zawierających ANS i wodę oraz inne substancje takie jak mocznik, KCl, czy glukoza. Należało następnie odczytać ze sporządzonych wykresów wartość CMC. Należało także zmierzyć fluorescencję ANS w roztworze Tritonu i w wodzie dla długości fali od 460 nm do 570 nm i sporządzić wykres widma fluorescencji.

Pomiary

V­Triton [ml]	CTriton [mol/dm^3]	Ifulorescencji w wodzie [mV]	Ifulorescencji w 1,5 M moczniku [mV]	Ifulorescencji w 0,5 M KCl [mV]	Ifulorescencji w 0,5 M glukozie [mV]
0,5
1
1,5
2
2,5
3
3,5
4
4,5
5

λem [nm]	Ifulorescencji w 2·10^-3 M roztworze Tritonu [mV]	Ifulorescencji w wodzie [mV]
460 465 470 475 480 485 480 485 490 495 500 505 510 515 520 525 530 535 540 445 550 555 560 565 570

Opracowanie wyników

Obliczenie stężenia Tritonu – przykładowo dla objętości Tritonu V_Tritonu=0,5 ml:

stężenie wyjściowe Tritonu c=10^-3 mol/dm³

objętość całej próby V=10 ml

$$c_{\text{Tritonu}} = \frac{V_{\text{Tritonu}} \bullet c}{V} = \frac{0,5\ ml \bullet 10^{- 3}\ mol/\text{dm}^{3}}{10ml} = 5 \bullet 10^{- 5}\ mol/\text{dm}^{3}$$

Wartości krytycznego stężenia tworzenia miceli odczytane z wykresów:

W wodzie: CMC=2,05·10^-4 mol/dm³

W moczniku: CMC_M=2,25·10^-4 mol/dm³

W glukozie: CMC_g=1,85·10^-4 mol/dm³

Wnioski

Dla roztworów Tritonu w wodzie, w moczniku i w glukozie, na początku, przy wzroście stężenia detergentu fluorescencja rosła bardzo nieznacznie, potem następował gwałtowny wzrost fluorescencji przy stężeniu zwanym stężeniem krytycznym tworzenia miceli. Powodowane to było tworzeniem się miceli powyżej wartości CMC i lokowaniem się cząsteczek ANS w niepolarnym ich wnętrzu, gdzie wydajność fluorescencji znacznie rośnie. Z wykresów tych można było odczytać wartości CMC:

W wodzie: CMC=2,05·10^-4 mol/dm³

W moczniku: CMC_M=2,25·10^-4 mol/dm³

W glukozie: CMC_g=1,85·10^-4 mol/dm³

Na wykresie zależności natężenia fluorescencji od stężenia Tritonu w KCl niestety nie można zaobserwować takiej zależności, a co za tym idzie nie można odczytać wartości CMC. Wynikać to może z błędów w sporządzaniu tej serii próbek.

Jak widać z otrzymanych wyników dodatek mocznika powoduje wzrost wartości CMC, gdyż jest to związek niszczący pseudokrystaliczną strukturę wody, ułatwiający hydratację. Dodatek glukozy obniża wartość CMC, gdyż jest związkiem utrwalającym strukturę wody, co utrudnia hydratację. Z danych teoretycznych wiadomo, że dodatek mocnych elektrolitów, jakim jest KCl, powinien obniżyć w niewielkim stopniu krytyczne stężenie tworzenia miceli poprzez wysolenie hydrofobowych łańcuchów ze środowiska wodnego, nie udało się jednak tego zaobserwować.

Odczytane z wykresu widma maksimum fluorescencji w roztworze Tritonu wynosi 485 nm, a w wodzie wynosi 505 nm. Fluorescencję roztworów Tritonu mierzyliśmy przy długości fali 490 nm, a więc bardzo zbliżonej do wartości maksimum odczytanego z wykresu widma.