20. Proszę opisać metodę uzyskiwania komórek kompetentnych E. coli i wyjaśnić w jakim procesie są one używane.

Transformacja jest procesem, w którym informacja genetyczna w postaci DNA jest przekazywana do biorcy bez kontaktu komórek lub pośrednictwa faga. DNA wyizolowany z komórek dawcy jest aktywnie pobierany przez komórki biorcy.

Proces transformacji został opisany u wielu rodzajów bakterii; najwyższą częstość transformacji uzyskuje się w obrębie tego samego gatunku (tak jest np. w przypadku bakterii z rodzaju Haemophilus), znacznie niższą - między gatunkami. Wysoką aktywność transformującą wykazuje DNA natywny, dwuniciowy. Wydajność transformacji zależy między innymi od stężenia DNA i od kompetencji komórek biorcy. Zwiększenie stężenia DNA powyżej dawki nasycającej nie powoduje wzrostu liczby transformantów.

U wielu bakterii (Haemophilus, Streptococcus, Bacillus) pobieranie DNA z otoczenia jest rezultatem ich naturalnego stanu kompetencji.

Natomiast w przypadku szczepów Escherichia coli stan kompetencji bakterii uzyskuje się na drodze indukcji chemicznej (traktowanie komórek bakteryjnych jonami wapnia). Metoda wykorzystująca 0,1 M roztwór chlorku wapnia jest powszechnie stosowanym sposobem otrzymywania komórek kompetentnych.

Przygotowanie komórek kompetentnych E. coli

1. 50 ml pożywki LB zaszczepić 1 ml hodowli nocnej odpowiedniego szczepu E. coli,

2. hodowlę prowadzić w temperaturze 37°C z mieszaniem przez 2,5 - 3,0 godziny (do uzyskania OD₆₀₀ = 0,3 - 0,4),

3. zawiesinę komórek wirować przez 10 minut przy 3000 obr./min w temperaturze 4°C,

4. supernatant usunąć, uzyskany osad bakteryjny zawiesić w 20 - 25 ml 100 mM CaCl₂ i inkubować w łaźni lodowej 2 - 3 godzin,

5. zawiesinę wirować przez 10 minut przy 3000 obr./min w temperaturze 4°C,

6. supernatant usunąć, uzyskany osad bakteryjny zawiesić w 1 ml 100 mM CaCl₂,

7. bezpośrednio po przygotowaniu komórki kompetentne E. coli transformować plazmidowym DNA.

21. Proszę opisać i zdefiniować rolę ligacji w uzyskiwaniu rekombinantów.

Ligacja jest to formowanie wiązań fosfodiestrowych pomiędzy końcem hydroksylowym 3` a końcem fosforowym 5` DNA. Dzięki enzymom restrykcyjnym możliwe jest reperowanie jednoniciowych przerw w dupleksie DNA, łączenie fragmentów restrykcyjnych posiadających homologiczne lepkie, czy też nawet tępe końce.

W technice rekombinowania i klonowania DNA dla celów ligacji najczęściej są stosowane dwa enzymy: ligaza DNA E.coli i ligaza DNA z faga T4. Tylko ta ostatnia jest w stanie wydajnie łączyć tępe końce, nawet w normalnych warunkach reakcji. Wadą jest jej mniejsza specyficzność rozpoznawania struktury końców, co daje większe tło w doświadczeniach spowodowane nieprawidłowymi ligacjami.

Najpowszechniej stosowaną techniką łaczenia obcego DNA z DNA wektora jest:

1. przecięcie wektora tym samym enzymem restrykcyjnym, jak był użyty do pofragmentowania obcego DNA

2. potraktowanie ligazą mieszaniny fragmentów DNA i cząsteczek wektora.

Przy takim podejściu eksperymentalnym zachodzi nie tylko łączenie fragmentów obcego DNA z DNA wektora, ale również łączenie się ze sobą fragmentów DNA i łączenie lepkich końców wektora, co prowadzi do zamknięcia się wektora bez integracji fragmentu obcego DNA. Temu ostatniemu procesowi można zapobiec działając alkaliczną fosfatazą (usuwa gr. fosforanową z końca 5' łańcucha DNA) na cząsteczki wektora przeciętego uprzednio enzymem restrykcyjnym. Działanie fosfatazą nie przeszkadza w łączeniu się wektora z obcym DNA, którego fragmenty posiadają wolne grupy fosforanowe na końcach 5'.

22. Proszę opisać, jakie formy plazmidowego DNA obserwujemy po jego rozdziale w żelu agarozowym z dodatkiem EtBr.

- forma CCC migruje najszybciej

- forma OC (nicked circular) i liniowa wędrują wolniej

23. Proszę objaśnić rolę odczynników NaOH i chlorowodorku guanidyny w izolacji DNA plazmidowego.

NaOH - jest czynnikiem odpowiedzialnym za lizę komórek

chlorowodorek guanidyny - sól chaotropowa, zwiększa powinowactwo DNA do żelu krzemionkowego

24. Proszę objaśnić rolę 0,1M CaCl₂ w transformacji komórek kompetentnych, oraz bromku etydyny w elektroforezie DNA plazmidowego w żelu agarozowym.

CaCl₂ - zwiększa przepuszczalność ściany komórkowej dla egzogennego DNA

Bromek etydyny - jest czynnikiem interkalującym, który może wklinować się pomiędzy zasady DNA i wykazywać fluorescencję w świetle UV. ssDNA i RNA mogą także wiązać EtBr, ale w mniejszych ilościach.

4

---