Zrozumienie wspólczesnej biologii molekularnej i biologii komorki wymaga znajomości standardowych metod laboratoryjnych jak i ustawicznej aktualizacji wiedzy o najnowszych technikach eksperymentalnych

BIOLOGIA KOMÓRKI: 9-13 STYCZNIA 2012
Podstawy analizy strukturalnej i funkcjonalnej białek

W każdej żywej komórce białka są podstawowymi jednostkami budulcowymi i funkcjonalnymi. Począwszy od ich
roli w mechanizmach replikacji i transkrypcji DNA, a skończywszy na produkcji, przetwarzaniu i sekrecji białek,
kontrolują one procesy podziału komórek, metabolizmu, przepływ materiału i informacji z i do komórek.

Zrozumienie jak działają komórki wymaga m.inn. zrozumienia jak funkcjonują białka w komórkach, a co za tym
idzie odpowiedzi na szereg pytań takich jak lokalizacja danego funkcjonalnego białka w komórce, identyfikacja
białek i innych makrocząsteczek z którymi oddziałuje (np białkowe czynniki transkrypcyjne oddziaływać będą nie
tylko z sobą ale i z DNA), następnie określenie w jakich przedziałach komórkowych jest aktywne, jakie drogi
sygnalizacji wewnątrzkomórkowej reguluje, jaka jest jego rola we wzroście i rozwoju organizmu itd.

PRZEWIDYWANIE STRUKTURY BIAŁEK:

Z  sekwencji  aminokwasów:  Umożliwia  przewidzieć  strukturę  3D  i  funkcję  białka  w  oparciu  o  porównanie
sekwencji  aminokwasów  (struktury  I-rzędowej)  danego  białka  do  homologicznych  białek.  Porównanie
umożliwiają  programy  dostępne  nieodpłatnie  w  Internecie  jak  np  BLAST  (zob.  rysunek  poniżej).  Skład

aminokwasowy

białka

można

ustalić

przez

hydrolizę

wszystkich

wiązań

peptydowych

kwasem (6M HCl, 110°C,
24h)

rozdział

chromatograficzny
uzyskanych aminokwasów.
Wówczas określić można
ile w danym białku znajduje
się

glicyn,

seryn

itp.

Ustalenie jednak sekwencji
aminokwasów

wymaga

podzielenia

białka

pewną liczbę krótszych
peptydów. W tym celu
stosuje

się

specjalne

enzymy proteolityczne (np.

trypsyna,  proteaza  V8)  lub  odczynniki  (np.  bromek  cyjanogenu),  które  niszczą  tylko  określone  wiązania
peptydowe.  Każdy  z  peptydów  jest  następnie  poddany  degradacji  Edmana  w  automatycznym  sekwenatorze
białek.  W  procesie  degradacji  Edmana  bierze  udział  N-końcowy  aminokwas,  który  po  potraktowaniu  kwasem
jest uwalniany jako odpowiednia pochodna. Identyfikuje się ją chromatograficznie i porównuje do odpowiednich
standardów.  Cykl  opisanych  wyżej  reakcji  powatrza  się,  by  zidentyfikować  kolejny  aminokwas  na  końcu  N

białka.  Kolejność  zaś  peptydów  w  oryginalnym  białku
ustala  się  poprzez  sekwencjonowanie  peptydów  po
trawieniu  białka  proteazami  o  różnej  specyficzności  i
wyszukiwaniu  nakładających  się  sekwencji  aminokwasów
(zob.  rysunek  obok;  T:  trawienie  trypsyną,  V:  trawienie
proteazą  V8).  Metoda  ta  jest  jednak  bardzo  kosztowna  i
pracochłonna,  w  dodatku  bardzo  zgrubna  i  nie  dokladna
jeśli  chodzi  o  przewidywanie  struktury  3D  białek.  Dlatego
też obecnie większość sekwencji aminokwasowych białka
poznaje  się  obecnie  w  sposób  pośredni  poprzez
sekwencjonowanie  DNA  genu  lub  komplementarnego
DNA (cDNA).

BIOLOGIA KOMÓRKI: 9-13 STYCZNIA 2012
Podstawy analizy strukturalnej i funkcjonalnej białek

Krystalografia rentgenowska:
Podstawowa metoda

pozwalająca

duża

dokładnością

określić

strukturę 3D białek. Warunkiem i
najtrudniejszym etapem tej metody
jest

otrzymanie

odpowiednich

kryształów  białek,  które  posłużą  do
badań  krystalografii.  Promienie  X
oddziałują  z  elektronami  substancji,
przez  która  przechodzą.  Mierząc
wzór  ugięcia  (dyfrakcji)  strumienia
promieni  X  przechodzących  przez
kryształ, oblicza się i ustala pozycję
atomów  w  krysztale.  W  ten  sam
sposób

bada

się

kompleksy

makrocząsteczek.  W  kompleksach,  np.  enzymu  z  substratem,  można  zidentyfikować  np.  międzycząsteczkowe
oddziaływania  odpowiedzialne  za  wiązanie  i  katalizę.  Wiele  białek,  zwłaszcza  błonowych,  jest  bardzo  trudno
skrystalizować.  Jednym  z  trudniejszych  zadań  ostatnich  lat  (2001)  było  skrystalizowanie  rybosomu  i
opracowanie jego struktury 3D.

Spektroskopia jądrowego rezonansu magnetycznego (NMR): Technika ta pozwala na zmierzenie relaksacji
w silnym polu magnetycznym protonów po ich wzbudzeniu falami o częstotliwości radiowej. Właściwości
relaksacji zależą od względnej pozycji protonów w cząsteczce. Badania dla białek muszą byc wielowymiarowe,
by zinterpretować nakładające się dane uzyskane z dużej liczby protonów. Dodatkowo, by polepszyć
rozdzielczość uzyskanych danych, można zastąpić w białku izotopy

C i

N odpowiednio

C i

N. Przez wiele

lat technika ta była wykorzystywana do analizy struktury małych cząsteczek. Coraz częściej technika ta jest
stosowana do analizy struktury makrocząsteczek (głównie białek) o masie do 20 kDa, a ostatnio nawet do 100
kDa i analizy poszczególnych domen białkowych. Ponadto, metoda ta nie wymaga uprzedniego skrystalizowania
próbki a jedynie odpowiednio wysokich stężeń próbki białka. Ze względu na obecność białka w roztworze można
tez badać zmiany konformacyjne białek np. w oddziaływaniach z innymi białkami, zmiany

konformacji

poszczególnych

domen

białkowych

, a także strukturę innych makroczęsteczek niż białka, jak RNA czy np.

łańcuchów węglowodanowych glikoprotein.

NOWOCZESNE METODY DYNAMICZNEGO BADANIA BIAŁEK:

Śledzenie lokalizacji i przemieszczania białka w komórce:

Fuzja  białek  z  GFP  (z  ang.  GFP-Fusion  proteins;  GFP-Green
Fluorescent Protein) umożliwia śledzenie lokalizacji określonego białka w
komórce a tym samym przewidywanie jego funkcji w oparciu o lokalizację.
Np  białko,  które  pod  wpływem  czynnika  wzrostowego  wędruje  z
cytoplazmy do jądra może odgrywać rolę w regulacji ekspresji genów.

Wprowadzanie etykiet (z ang. epitope tagging) polega na wprowadzaniu
krótkich sekwencji kodujących kilka do kilkunastu aminokwasów.
Sekwencje te są rozpoznawane przez komercyjnie dostępne przeciwciała.
Stosując takie przeciwciała wyznakowane odpowiednim znacznikiem (np.
fluorescencyjnym) możemy podobnie jak w poprzednim przypadku śledzić
drogę białka w komórce.

BIOLOGIA KOMÓRKI: 9-13 STYCZNIA 2012
Podstawy analizy strukturalnej i funkcjonalnej białek

Poznanie partnerów z którymi dane białko oddziałuje:

Jeśli słabo scharakteryzowane białko wiąże się z białkiem o zdefiniowanych funkcjach w komórce to jest wysoce
prawdopodobne, że badane białko spełniać będzie podobne funkcje.

Jedną  z  najprostrzych  metod  pozwalających  zidentyfikować  białka  wiążące  się  ściśle  ze  sobą  to  metoda  ko-
immunoprecypitacji. W metodzie immunoprecytpitacji wykorzystujemy przeciwciała wiążące się specyficznie z
określonym białkiem, które chcemy „wyłowić” z mieszaniny różnych białek. Przeciwciała te zwykle wiąże się na
odpowiednim  materiale  (np.  kulkach  sefarozowych)  umożliwiającym  odseparowanie  interesującego  nas  białka
od pozostałych (np. poprzez zwirowanie zawieszonych w mieszaninie w.w. kulek sefarozowych opłaszczonych
przeciwciałami i danym białkiem). Jeśli interesujące nas białko wiąże się ściśle z innym partnerem-białkiem, na
dnie  probówki  znajdzie  się  cały  kompleks  (ko-immunoprecypitacja).  Takie  sprecypitowane  kompleksy  można
następnie  rozdzielić  elektroforetycznie,  aby  np.  poznać  masę  cząsteczkową  partnerów  i/lub  zidentyfikować
poszczególnych partnerów z użyciem specyficznych przeciwciał dla domniemanych partnerów.

Badania odziaływania białko-białko z
wykorzystaniem

GFP

jego

pochodnych: Każde z interesujących
nas

białek

jest

wyznakowane

odpowiednim

znacznikiem

fluorescencyjnym (fluorochromem) w taki
sposób,  że  fala  emitowana  przez  jeden
fluorochrom  może  być  absorbowana
przez  drugi.  Jeśli  dwa  interesujące  nas
białka  oddziałują  ze  sobą  (w  praktyce:
zbliżają  się  do  siebie  na  odległość  ok  1-
10  nm),  wówczas  dochodzi  do  procesu
przekazania

energii

jednego

fluorochromu  na  drugi;  proces  ten  jest
zwany  FRET  (z  ang.  fluorescence
resonanse  energy  transfer).  Pomiary
FRET  dokonuje  się  m.in.  wzbudzając
jeden fluorochrom i mierząc absorbancję
drugiego.

BIOLOGIA KOMÓRKI: 9-13 STYCZNIA 2012
Podstawy analizy strukturalnej i funkcjonalnej białek

ELEKTROFOREZA BIAŁEK

Białka zwykle posiadają wypadkowy ładunek ujemny bądź dodatni, w zależności od naładowania aminokwasów,
które je budują. Kiedy

białka

są

rozdzielane

polu

elektrycznym,

wędrują

one

zależności

ich

wypadkowego

ładunku,

rozmiaru

oraz

kształtu

. Technika ta nazywana jest ELEKTROFOREZĄ.

Od lat 60’ych najpopularniejszym sposobem rozdziału i analizy białek jest elektroforeza w SDS na żelach
poliakrylamidowych.

Żel poliakrylamidowy jest przygotowany z monomerów tak, by pory żelu miały określoną wielkość, a białka
zawiesza się w roztworze SDS, który jest detergentem o silnym ładunku ujemnym.

Zawieszenie białek w roztworze SDS powoduje:

Rozwinięcie struktury 3D białek i uzyskanie rozciągniętego
łańcucha polipeptydowego, ponieważ SDS wiąże się z rejonami
hydrofobowymi białka

Dysocjację większości kompleksów białkowych i białkowo-
lipidowych do poszczególnych makrocząsteczek

Opłaszczenie struktur hydrofobowych białek przez SDS i nadanie
im przeważającego ładunku ujemnego. Umożliwia to rozdział
białek w wodnych roztworach a nierozpuszczalne w wodzie białka
stają się rozpuszczalne w wodzie.

Jeśli dodamy do roztworu białka w SDS dodatkowy czynnik redukujący,
np. β-merkaptoetanol, powodujemy przerwanie wiązań dwusiarczkowych (-
S-S-) w białku, a tym samym umożliwiamy analizę poszczególnych
podjednostek polipeptydowych w makrocząsteczkach.

Rozdział białek zawieszonych w SDS na żelu poliakrylamidowym odbywa się wyłącznie

oparciu

masę

cząsteczkową danego białka ponieważ:

wszystkie białka mają podobny kształt po rozwinięciu ich struktury 3D w SDS (wędrują więc z podobną
prędkością)

wszystkie białka wiążą podobną ilość SDS (mają więc podobny ładunek ujemny)

Żel poliakrylamidowy działa jak sito molekularne i powoduje, że większe białka są na nim zatrzymywane dłużej,
a mniejsze wędrują szybciej.

UWAGA: Innym prostym sposobem rozdziału cząsteczek i makrocząsteczek w zależności od ich
rozmiaru jest filtracja

żelowa

(odmiana chromatografii kolumnowej).

W tej metodzie kolumna jest wypełniona porowatą macierzą i wówczas mniejsze cząsteczki zdolne
zmieścić się w porach wypełniacza zatrzymywane będą na kolumnie dłużej niż większe, które
wypłukiwane będą najszybciej z kolumny.

Po elektroforetycznym rozdziale białek, można je wybarwic bezpośrednio w żelu np. błękitem kumazyny (z ang.
Coomassie blue). Dokładniejszą detekcję zapewniają barwniki na bazie srebra i złota (do 10 ng białka).

BIOLOGIA KOMÓRKI: 9-13 STYCZNIA 2012
Podstawy analizy strukturalnej i funkcjonalnej białek

http://www.biology.arizona.edu/immunology/activities/western_blot/west1.html

ELEKTROFOREZA DWUKIERUNKOWA:

Wyspecjalizowaną odmianą elektroforezy białek jest elektroforeza dwukierunkowa, która łączy dwie metody
rozdziału białek w jedną, a mianowicie ogniskowanie

izoelektryczne

oraz elektroforezę w SDS. W pierwszym

etapie białka rozdziela się w

oparciu

ich

własny

ładunek

wypadkowy.

Każde białko posiada swoisty punkt

izoelektryczny, czyli takie pH, przy którym dane białko nie posiada żadnego ładunku i nie wędruje w polu
elektrycznym. W praktyce więc mieszaninę białek rozdziela się wpierw w gradiencie pH, gdzie białka wędrują do
pH odpowiadającego ich punktowi izoelektrycznemu i tam zostają. W drugim etapie rozdzielone wstępnie białka
poddaje się klasycznej elektroforezie w SDS.

W ten sposób można rozdzielić nawet do 2000 białek, czyli tyle, ile np. występuje w komórkach bakterii E.coli. W
dodatku metoda ta jest tak czuła, że pozwala rozdzielić dwa białka różniące się tylko jednym odmiennie
naładowanym aminokwasem.

Rozdzielone białka można następnie wykryć albo bezpośrednio

żelu

używając odpowiednio czułych metod

detekcji,  takich  jak  barwienia  na  bazie  srebra  i  złota,  bądź  poprzez  znakowanie  mieszaniny  białek
radioizotopowo  i  detekcję  rozdzielonych  białek  metodami  autoradiografii.  Alternatywnie,  po  przeniesieniu
rozdzielonych  białek  na  odpowiednie  filtry

nitrocelulozowe

(metoda Western blot), detekcję rozdzielonych

białek dokonuje się za pomocą przeciwciał znakowanych radioizotopowo, enzymatycznie lub fluorescencyjnie.

BIOLOGIA KOMÓRKI: 9-13 STYCZNIA 2012
Podstawy analizy strukturalnej i funkcjonalnej białek

IDENTYFIKACJA BIAŁEK (nieodzowna część PROTEOMIKI – nauki mającej na celu identyfikację i analizę
wszystkich białek występujących w danym typie komórek i rosnących w ściśle zdefiniowanych warunkach)

Po rozdziale mieszaniny białek metodą elektroforezy dwukierunkowej, poszczególne białka można poddać
analizie wycinając je z żelu i poddając trawieniu enzymami proteolotycznymi.

Trawienie białek: Np. Trypsyna

tnie

lizynie

i argininie

C-końca

każdego

białka

; a użycie bromku

cyjanogenu powoduje cięcie

wiązań

peptydowych

tylko

przy

metionine

Uzyskane fragmenty rozdziela się za pomocą chromatografii lub elektroforezy, a uzyskany wzór prążków (mapa
peptydowa) porównuje do istniejących map innych białek. W.w. metodę wykorzystano po raz pierwszy do
identyfikacji

mutacji

hemoglobinie

pacjentów z anemią sierpowatą; Wykazano różnicę w pojedynczym

peptydzie i jak się póżniej okazało była to różnica związana z zamianą jednego z aminokwasów na inny.
Obecnie w.w. metodę używa się najczęściej do identyfikacji modyfikacji

potranslacyjnych

białek

Spektroskopia masowa typu MALDI: Metoda ta pozwala precyzyjnie określić masę

cząsteczkową

białek i/lub

peptydów  otrzymanych  z  nich  w  procesie  trawienia  enzymatycznego  lub  chemicznego.  Podstawą  działania
każdego spektrometru, bez względu na konstrukcję, jest jonizacja cząsteczek badanej substancji, co umożliwia
przyspieszenie  jej  w  polu  elektrycznym  w  próżni.  Jonizację  próbki  można  przeprowadzić  na  wiele  różnych
sposobów  (np.  jonizacja  chemiczna,  gdzie  jonizacja  substancji  następuje  na  skutek  zderzeń  z  tzw.  jonami
pierwotnymi  występującymi  w  źródle  jonów  –  najczęściej  są  to  jony  gazów  obojętnych,  metanu,  izobutanu,
amoniaku).  Istnieje  też  możliwość  oznaczenia  m/z  substancji  nie  jonizujących  się  poprzez  dołączenie  (reakcja
chemiczna  lub  oddziaływanie  fizyczne)  podstawnika  obdarzonego  ładunkiem  lub  podlegającego  jonizacji  (tzw.
derywatyzacja)  lub  poprzez  utworzenie  adduktów  np.  z  sodem  lub  potasem.Heterogeniczny  strumień  jonów
(dodatnich  lub  ujemnych)  zostaje  rozdzielony  na  szereg  składowych,  zależnie  od  stosunku  masy  do  ładunku
(m/z). Uzyskuje się swoisty wzór mas cząsteczkowych peptydów badanego białka i porównuje go z bazą danych
opracowaną  dla  wszystkich  dotychczas  zidentyfikowanych  białek,  dla  których  masa  wypadkowa  i  masa
cząstkowych peptydów zostały określone z użyciem podobnych metod.

Spektrometria masowa jest bardzo

czuła

, wymaga do badań niewielkiej

ilości

próbki

białka

i jest bardzo

dokładna (błąd pomiaru masy cząsteczkowej jest rzędu 0.000001), pozwala zmierzyć masę cząsteczkową białek
tak dużych jak 200 kD odpowiadających łańcuchowi polipeptydowemu o długości 2000 aminokwasów.

Metoda  ta  pozwala  również  określić  sekwencję  aminokwasów  dla  poszczególnych  fragmentów  peptydów  a
także  określić  rodzaj  modyfikacji  tych  peptydów,  jak  np.  łańcuchy  węglowodanowe,  grupy  fosforanowe,  grupy
metylowe  itp.  Dlatego  metoda  ta  stała  się  konkurencyjna  w  stosunku  do  degradacji  Edmana  jako  metoda
sekwencjonowania  białek  i  umożliwia  identyfikację  modyfikacji  posttranslacyjnych,  czy  analizę  związków
endogennych  występujących  w  bardzo  niskich  stężeniach.  Pojedyncze  aminokwasy  posiadające  interesujące
nas modyfikacje mogą być wykryte, ponieważ z użyciem tej metody bedą wykazywały charakterystyczny wzrost
masy cząsteczkowej. Technika ta znajduje również zastosowanie w dziedzinach takich jak ochrona środowiska,
kontrola  antydopingowa,  farmakologia,  diagnostyka  medyczna,  biotechnologia  czy  ostatnio  w  dynamicznie  się
rozwijającej proteomice.