Genetyka wykład 3 15.03.2018

Ustalanie kolejności nukleotydów w cząsteczkach DNA

Problemy:

- długość cząsteczek DNA

- występują w kompleksie z białkami

- kompleksy są nierozpuszczalne

- po zastosowaniu specjalnych metod można uzyskać cząsteczki DNA odbiałczonego, ale nie jest łatwo uzyskać jednorodne cząsteczki DNA do dalszej obróbki

Powielanie fragmentów DN:

- klonowanie

- PCR – reakcja łańcuchowa polimerazy

Enzymy restrykcyjne białka które tną DNA w specyficznej sekwencji nukleotydowej

Klonowanie fragmentów DNA – umieszczamy wyizolowany kawałek DNA do bakterii (tworząc plazmidy) która się co 20 min dzieli razem z wyciętym kawałkiem DNA. Dzięki temu w krótkim czasie otrzymujemy wiele sklonowanych tych samych wyizolowanych kawałków łańcucha DNA.

Biblioteka genomowa – zbiór bakterii posiadający łącznie cały genom człowieka, każda z nich zawiera plazmoid z kawałkiem sekwencji.

PCR – polega na cyklicznej syntezie DNA

Główne etapy reakcji PCR:

- denaturacja wyjściowych cząsteczek DNA

- wiązanie primerów (annealing)

- wydłużanie łańcucha (extension)

TaqMan – szacowanie ilości cząsteczek matrycowych

Pierwsze metody sekwencjonowania DNA:

- sekwencjonowanie metodą chemicznej degradacji DNA

- sekwencjonowanie oparte o syntezę (obserwowanie nukleotydów przyłączających się do łańcucha)

- sekwencjonowanie DNA metodą terminacji łańcucha

- sekwencjonowanie oparte o hybrydyzację

Metody głębokiego selekcjonowania