Metody 

immunologiczne

Opracowała: Agata 

Śniegowska

 

Metody immunochemiczne z 

zastosowaniem znacznika:

1. radioimmunologiczne (izotopowe)

2. immunoenzymatyczne (nieizotopowe)

3. immunofluorescencyjne (nieizotopowe)

Metoda radioimmunologiczna (RIA)

• Wykrywanie promieniowania izotopów promieniotwórczych 

w odniesieniu do składowej reakcji antygen – przeciwciało,

• antygen lub przeciwciało znakowane jest izotopem, 
• przy pomocy znanych ilości antygenu lub przeciwciała 

tworzy się równoległą krzywą niezbędną do porównania 
otrzymanego wyniku,

• reakcja może przebiegać w środowisku płynnym lub 

stałym,

• metoda charakteryzuje się dużą czułością.

Metody radioimmunologiczne można podzielić na:

•

kompetycyjną (współzawodnictwa),

•

bezpośrednią.

Metoda kompetycyjna

• Zachodzi reakcja pomiędzy 

przeciwciałem a oznaczonym 
antygenem w obecności znanej ilości 
znakowanego izotopem antygenu,

• zarówno znakowany, jak i 

nieznakowany antygen 
współzawodniczą o przeciwciało,

• metoda ta jest stosowana, m.in. do 

oznaczania hormonów, enzymów, 
białek płodowo – nowotworowych.

Metoda kompetycyjna

Etapy przebiegu reakcji:

1) interakcja przeciwciało – antygen (antygen przyczynia się 

do utworzenia dwóch frakcji: związanej i niezwiązanej),

2) rozdział i izolacja (kompleks powstały ze związania 

znakowanego antygenu z przeciwciałem oddziela się z 
mieszaniny poprzez wysalanie wysokimi stężeniami soli, 
np. siarczanem amonu),

3) odczyt poziomu radioaktywności (wynik stanowi stosunek 

promieniowania związanego z kompleksem do całkowitej 
ilości podanego izotopu).

Metoda bezpośrednia

• Znakowany antygen poddaje się reakcji z 

materiałem, w którym poszukujemy 
danych przeciwciał. 

• Powstały kompleks (znakowany antygen – 

przeciwciało) wytrąca się z roztworu, a 
następnie mierzy radioaktywność związaną 
z osadem. 

• Stężenie badanego przeciwciała uzyskuje 

się z wykonanej równolegle krzywej 
kalibracyjnej.

Metody nieizotopowe

W metodach tych zamiast izotopu 
stosuje się inne znaczniki, np. 
enzymy, fluorochromy.

Ze względów bezpieczeństwa 
metody nieizotopowe stosowane są 
częściej aniżeli izotopowe.

Metoda immunoenzymatyczna 

(EIA)

• W metodzie tej antygen lub przeciwciało sprzęga 

się z enzymem, a pomiar produktu powstającego 
w reakcji enzymatycznej rozkładającej określony 
substrat jest miernikiem ilościowym. 

• Produkt reakcji jest barwny. Natężenie barwy 

zależy pośrednio od zawartości oznaczanego 
antygenu, czy przeciwciała i jest mierzone z 
użyciem metod spektrofotometrycznych.

• Najczęściej stosowanymi enzymami są:

-

 fosfataza alkaliczna (AP)

- peroksydaza chrzanowa (HRP)
- oksydaza glukozowa (GO)

Metoda immunoenzymatyczna 

(ELISA)

TEST ELISA jest jednym z 
najpowszechniej stosowanych testów 
w badaniach biomedycznych 
(naukowych oraz diagnostycznych). 
Służy do wykrycia określonych białek 
w badanym materiale z użyciem 
przeciwciał poliklonalnych lub 
monoklonalnych skoniugowanych z 
odpowiednim enzymem.

Metody immunoezymatyczne 

(ELISA)

Są to metody heterogenne (jedna z 
reakcji składowych jest związana z 
fazą stałą). 
Wyróżnia się:

• metody kompetycyjne,
• metody pośrednie,
• metody kanapkowe.

Metoda kompetycyjna 

(ELISA)

• Obowiązująca tu zasada jest podobna do metod 

kompetycyjnych izotopowych. Przeciwciało 
związane jest jednak z fazą stałą. Badany 
antygen współzawodniczy z antygenem 
znakowanym (enzymem, fluorochromem). 
Zależność związana z przyłączaniem się 
antygenu do przeciwciała jest odwrotnie 
proporcjonalna do przeciwciała znakowanego. 

• Natężenie zabarwienia jest tym większe, im 

mniejsza zawartość badanego antygenu.

Metoda pośrednia 

(ELISA)

• Faza stała (powierzchnia płytki) opłaszczana jest 

antygenem. Następnie umieszczane są badane 
przeciwciała, które w czasie inkubacji wiążą się z 
opłaszczonym antygenem. Po płukaniu dodaje się 
przeciwciała skierowane przeciw badanym 
białkom, znakowane enzymem (metody 
immunoenzymatyczne) lub fluorochromem 
(metody immunofluorescencyjne). Po inkubacji 
ocenia się natężenie fluorescencji lub natężenie 
zabarwienia po dodaniu substratu (w przypadku 
metod immunoenzymatycznych). Wartości te są 
proporcjonalne do zawartości oznaczanego 
przeciwciała.

• Metoda stosowana do oznaczania danych 

przeciwciał, np. przeciw DNA, przeciw określonym 
wirusom, przeciwciał anty-HIV.

Metody kanapkowe 

(ELISA)

• Probówki lub mikropłytki opłaszczane są przeciwciałem. 

Dodawany jest badany antygen, który w czasie 
inkubacji wiąże się z przeciwciałem. Po płukaniu 
umieszcza się przeciwciała skierowane przeciw 
badanym antygenom, znakowane enzymem lub 
fluorochromem. Po inkubacji ustala się natężenie 
fluorescencji lub natężenie zabarwienia po dodaniu 
substratu (w metodach immunoenzymatycznych).

• Stosowane są do oznaczania różnych antygenów, np. 

immunoglobulin, składowych dopełniacza, wirusa 
Epsteina-Barra.

Metoda immunofluorescencyjna 

(FIA)

• W metodzie tej składowa reakcji immunologicznej wiąże się z 

fluorochromem. Najczęściej stosuje się zielony izocyjanian 
fluorescencyjny (FITC). Innym barwnikiem może być także 
czerwona rodamina (TRITC).

• Natężenie fluorescencji (wynik) mierzy się za pomocą 

spektrofluorometru.

• Dzięki istnieniu fluorochromów o różnych kolorach 

fluorescencji możliwa jest wizualizacja dwóch a nawet trzech 
antygenów w jednym preparacie tkankowym.

• Duża zaletą IMF jest możliwość wykonania reakcji na żywych 

komórkach, gdyż nie wymaga ona utrwalenia materiału.

TEST

HETEROGENNY

HOMOGENNY

KONKURENCYJNY

(WSPÓŁZAWODNICTWA)

NIEKONKURENCYJNY

POŚREDNI

KANAPKOWY