Diagnostyka
mikrobiologiczna
Romuald Krajewski
Diagnostyka
mikrobiologiczna
Romuald Krajewski
Badania mikrobiologiczne -
aspekty
•
Aspekt mikrobiologiczny
−
identyfikacja aktualnie występujących czynników etiologicznych z
określeniem ich właściwości jak: toksyczność, obecność otoczek, typ
serologiczny itp.
−
aktualny przegląd oporności na chemioterapeutyki i mechanizmów
oporności
−
ocena stopnia uodpornienia populacji wobec chorób infekcyjnych
•
Aspekt kliniczny
−
poszukiwanie związku między wykrytym drobnoustrojem, jego
właściwościami a objawami klinicznymi
−
prawidłowy dobór antybiotyków do terapii empirycznej i celowanej
−
analiza przyczyn niepowodzenia antybiotykoterapii
•
Aspekt epidemiologiczny
−
identyfikacja drobnoustrojów epidemicznych w oparciu o analizę cech
drobnoustrojów wywołujących zakażenia w określonym czasie i
środowisku
−
pomoc w ustalaniu źródeł i dróg szerzenia się zakażeń
(rozprzestrzeniania się drobnoustrojów epidemicznych)
−
monitorowanie rozprzestrzeniania się lekooporności.
Rola laboratorium
mikrobiologicznego
•
Badania mikrobiologiczne środowiska są
mało przydatne w zwalczaniu zakażeń
szpitalnych
•
Zadaniem laboratorium jest analiza flory
bakteryjnej u pacjentów w oddziałach
•
Laboratorium współpracuje z personelem
oddziałów w zakresie zapobiegania i
leczenia zakażeń
Rola laboratorium
mikrobiologicznego
•
Pobranie materiału do badania i
dostarczenie go do laboratorium
•
Identyfikacja drobnoustroju
(możliwie najbardziej szczegółowa)
•
Ocena wrażliwości na leki
Pobieranie materiału
•
Wymaz z nosogardła – badania w
kierunku nosicielstwa
•
Wacik zwilżony solą fizjologiczną
wprowadzany przez nos
•
Jałowa probówka z podłożem
transportowym
Pobieranie materiału
•
Wymaz z gardła
−Pobiera się z podniebienia, migdałków,
tylnej ściany gardła
−Nie należy dotykać języka ani
policzków
•
Plwocina
−Wątpliwa wartość diagnostyczna
−Pobiera się rano, po umyciu zębów
Pobieranie materiału
•
Oskrzela i płuca
•
Odsysanie zawartości oskrzeli – nie
można przez rurkę intubacyjną, ponieważ
pobiera się bakterie z rurki
•
BAL – popłuczyny pęcherzykowo-
oskrzelowe pobierane podczas
bronchoskopii
•
Zestawy szczoteczkowe
Pobieranie materiału -
krew
•
Prawidłowo pobrane próbki krwi u
zdrowych są zwykle jałowe
•
Bakteriemia występuje po myciu zębów,
ekstrakcji zębów, bakterie są usuwane w
ciągu <1 godziny
•
Dodatni wynik posiewu krwi ma znaczenie
tylko w połączeniu z objawami klinicznymi
•
Liczba bakterii we krwi jest niewielka, co
utrudnia hodowlę
Pobieranie materiału -
krew
•
Jałowy jednorazowy sprzęt
•
Nowe wkłucie (wyjątek – posiew z
cewnika)
•
Ogrzane podłoże
•
Natychmiast do laboratorium
•
Wielokrotne badania, pobieranie
przed szczytem gorączki
Pobieranie materiału -
krew
•
Specjalne podłoża w zależności od
spodziewanych bakterii – zwłaszcza
paciorkowców
•
Podłoża blokujące działanie antybiotyków
•
Automatyczne systemy identyfikujące
bakterie na podstawie aktywności
biochemicznej
Pobieranie materiału -
krew
•
Dezyfekcja korka butelki z podłożem i
miejsca wkłucia
•
Użycie środka odkażającego z jodyną do
wyschnięcia
•
Nie należy dotykać miejsca wkłucia
•
Pobieranie sterylnym zamkniętym
systemem
•
Parę (2-3) posiewów w ciągu 1-2 godzin
Pobieranie materiału -
ropień
•
Nakłucie i aspiracja
•
Głęboki wymaz z ropnia otwartego
•
Przechowywanie w podłożu
transportowym <2 godzin
•
Jeden posiew z jednego miejsca
dziennie
Pobieranie materiału -
cewnik
•
Przemycie skóry wokół cewnika
•
Usunięcie cewnika w sposób jałowy
•
Odcięcie ok. 5 cm i umieszczenie w
sterylnej próbówce (suchej lub z solą)
•
Cewnik bez soli – natychmiast do
laboratorium
•
Można przechowywać do 24 godzin w
niskiej temperaturze – 4st
Pobieranie materiału – płyn
mózgowo-rdzeniowy
•
Nakłucie lędźwiowe – wykonywane
przez lekarza
•
Dokładna dezynfekcja miejsca wkłucia
•
1-2 ml płynu sposobem zamkniętym w
temperaturze pokojowej
•
Transport do laboratorium w ciągu
<15 min
Pobieranie materiału –
wycinki tkanek
•
Sterylna probówka
•
Kilka kropli sterylnej soli
fizjologicznej
•
Zwykły transport – do laboratorium
w ciągu <15 min
•
Transport w systemie dla
beztlenowców - <24 godzin
Pobieranie materiału –
mocz
•
Dokładne mycie wodą z mydłem
•
Przetarcie jałowym gazikiem
•
Pobranie moczu ze środkowej części
strumienia do jałowego pojemnika
lub pojemnika z podłożem do
posiewu moczu
Pobieranie materiału – mocz z
cewnika
•
Jeżeli można nakłuć zbiornik moczu –
odkażenie miejsca nakłucia, pobranie 5-
10 ml do strzykawki, wprowadzenie do
jałowego pojemnika/probówki
•
Odkażenie zaworu, wypuszczenie
kilkudziesięciu ml, pobranie porcji do
jałowego pojemnika
•
Czas przechowywania <2 godzin
Badania bakteriologiczne
•
Preparaty bezpośrednie
•
Hodowla
•
Wykrywanie antygenów bakteryjnych
•
Wykrywanie DNA/RNA bakterii metodami
biologii molekularnej
•
Określenie poziomu przeciwciał w
surowicy i innych płynach ustrojowych
•
Próby na zwierzętach (rzadko)
Preparaty bezpośrednie
•
Barwienie
−negatywne – barwi się tło
−pozytywne – barwniki mające powinowactwo
do drobnoustrojów
−proste – pojedynczy barwnik
−złożone – liczne barwniki
•
Najczęstsza metoda – Grama
−bakterie G+ barwią się fioletem
krystalicznym na granatowo
−bakterie G- barwią się tylko barwnikiem
kontrastowym – fuksyna zasadowa
Preparaty bezpośrednie
•
Metoda Ziehl-Nielsena – fuksyna
karbolowa – bakterie zawierające w
ścianie komórkowej kwasy tłuszczowe
(Mycobacterium, Nocardia)
•
Metoda Giemsy – preparaty tkanek i
wykrywanie wirusów oraz Chlamydia
•
Metoda PAS – grzyby
Hodowla
•
Bardziej czuła niż preparat
bezpośredni
•
Bardziej kosztowna
•
Umożliwia określenie oporności na
antybiotyki
•
Stosuje się podłoża namnażające lub
selekcjonujące
Hodowla
•
Identyfikacja drobnoustroju – odbywa się
poprzez określenie właściwości
biochemicznych, najczęściej systemy
zautomatyzowane
•
Badanie oporności na antybiotyki –
metoda płytkowo-dyfuzyjna, metoda
pasków dyfuzyjnych, metoda
rozcieńczeniowa, metody automatyczne
Monitorowanie oporności
•
Gronkowce oporne na metycylinę
•
Enterokoki oporne na
aminoglikozydy i polipeptydy
•
Enterobacteriaceae wytwarzające
beta-laktamazy
•
Pseudomonas oporne na imipenem i
ciprofloksacynę
Testy lateksowe
•
Polegają na wiązaniu się specyficznych
przeciwciał (monoklonalnych) z
antygenami bakteryjnymi
•
Przeciwciała są umieszczone na nośniku
lateksowym lub krwinkach czerwonych
•
Nie zastępują hodowli, ale są szybsze i
ułatwiają podjęcie decyzji o leczeniu
Testy serologiczne
•
Polegają na łączeniu przeciwciał z
antygenem i wytrąceniu osadu lub
blokowaniu aktywności antygenu
•
Główne rodzaje odczynów serologicznych:
−precypitacji (antygeny rozpuszczalne)
−aglutynacji (wykrywanie przeciwciał i
antygenów)
−wiązania dopełniacza (blokowanie antygenów
lub liza komórek z udziałem dopełniacza)
−neutralizacja (zobojętnianie określonych
właściwości antygenu)
Metody serologiczne
•
Odczyn immunofluorescencji – przeciwciała znakowane
barwnikiem fluoryzującym, metoda pośrednia lub
bezpośrednia – wysoka czułość
•
Metody radioimmunologiczne – przeciwciała znakowane
izotopami
•
ELISA – znakowanie przeciwciał enzymami, które
następnie reagują z substancją chemiczną wytwarzając
barwnik, liczne odmiany metody
•
Immunobloting – elektroforeza białek i przeniesienie ich
na błonę, inkubacja w roztworze przeciwciał połączonych
z peroksydazą, która rozkłada barwnik – identyfikacja
antygenów białkowych i przeciwciał
Metody biologii
molekularnej
•
Pozwalają na szybką identyfikację drobnoustroju
i wdrożenie leczenia, ale nie eliminują potrzeby
posiewu i antybiogramu
•
Możliwa jest identyfikacja elementów ściany
bakteryjnej lub fragmentów kwasów
nukleinowych
•
Metody namnażania fragmentów DNA dają
ogromną czułość metod opartych na
identyfikacji specyficznych dla poszczegółnych
drobnoustrojów fragmentów DNA
Sondy genetyczne
•
Fragmenty DNA, które łączą się
komplementarnie ze ściśle im odpowiadającymi
fragmentami DNA drobnoustroju kodującymi
antygen, toksynę, oporność na lek, enzym itp
•
Cztery etapy:
− przygotowanie i denaturacja (rozdzielenie nici DNA)
materiału
− dodanie sondy i hybrydyzacja (połączenie)
− usunięcie niezwiązanej sondy
− wykrycie związanej sondy
•
Sondy wykrywające RNA są bardziej czułe,
ponieważ RNA występuje w wielu kopiach
Powielanie materiału
genetycznego
•
Polimerazowa reakcja amplifikacji (PCR) –
enzym jest niewrażliwy na temperaturę i w
podwyższonej temperaturze w kolejnych
cyklach syntetyzuje określone fragmenty
DNA
•
Produkty hybrydyzacji można oznaczyć
metodą elektroforezy lub swoistą sondą
•
Można zastosować do każdego (również
zdenaturowanego i utrwalonego) DNA
Zastosowania metod
molekularnych
•
Identyfikacja grzybów – Candida – hodowla trwa
długo i jest trudna, a zakażenia są bardzo
groźne – spektrograficzna identyfikacja d-
arabinitolu
•
Drobnoustroje wolno rosnące na podłożach –
Mycobacteria, Mycoplasma, Chlamydia, Borrelia
– metoda PCR umożliwia rozpoznanie w ciągu
24 godzin
•
Wirusy – HIV, EBV, HBV, HCV i inne – PCR i LCR
są podstawowymi metodami diagnostyki
Zastosowania metod
molekularnych
•
Oznaczanie zdolności wytwarzania toksyn i
enzymów
•
Wykrywanie genów oporności na antybiotyki
•
Typowanie genetyczne dla celów
epidemiologii zakażeń szpitalnych – ustalenie
czy mamy do czynienia z jednym szczepem,
czy różnymi ma wpływ na postępowanie
Gromadzenie i analiza
informacji
•
Diagnostyka mikrobiologiczna dostarcza
bardzo dużej liczby informacji
•
Konieczne jest stosowanie
komputerowych baz danych:
−ułatwia dostęp do danych
−umożliwia przeprowadzenie złożonych analiz
z wykorzystaniem licznych danych
−śledzenie zakażeń
−weryfikacja wyników
Podsumowanie
•
Przy pobieraniu materiału do badań
bakteriologicznych najlepiej jest
porozumieć się z laboratorium co do
techniki pobrania, podłoża, transportu
•
Nowoczesne metody pozwalają na bardzo
szczegółową identyfikację i
charakterystykę drobnoustrojów oraz
szybkie podjęcie właściwego leczenia