Modele zwierzęce chorób autoimmunizacyjnych

• Eksperymentalne autoimmunologiczne zapalenie

mózgu i rdzenia kręgowego (EAE) - choroba zapalna
ośrodkowego układu nerwowego powszechnie
wykorzystywana

jako

model

stwardnienia

rozsianego (multiple sclerosi, MS).

• Cechuje się okresami pogorszenia oraz remisji,

utratą przewodnictwa nerwowego oraz stałym
postępem niepełnosprawności.

• Makrofagi oraz limfocyty T pośredniczą w destrukcji

osłonki mielinowej otaczającej nerwy, prowadząc do
zakłócenia przewodnictwa impulsów nerwowych.

Główną metodą indukcji EAE u zwierząt jest

immunizacja przy pomocy białka substancji białej

OUN, takiego jak:

• podstawowe białko mieliny (BMP),
• białko proteolipidowe (PLP),
• mielinowa glikoproteina oligodendrocytów (MOG),

co skutkuje powstaniem ostrej postaci choroby o

cechach MS.

Poprzez użycie różnych antygenów i adjuwantów,

można uzyskać przewlekłą, nawracającą postać EAE.

• Ostre śmiertelne EAE - gwałtowny spadek masy ciała, osłabienie

tylnych  kończyn,  zaburzony  chód  zwierzęcia,  gwałtownie
przekształcający  się  w  paraliż  zaatakowanych  kończyn,
nietrzymanie  moczu  i  osłabione  oddychanie,  śmierć  zwierzęcia
krótko po immunizacji.

• Przewlekłe postępujące EAE – powolny rozwój choroby, ale

postępujący w przeciągu dwóch tygodni.

• Przewlekłe nawracające EAE - rozwój ostrej postaci choroby z

różnorodną  intensywnością.  Objawy  choroby  łagodne  takie,  jak
osłabienie  kończyn  tylnych,  zaburzony  chód  oraz  nietrzymanie
moczu  lub  ostra  paraplegia  tylnych  kończyn.  Po  całkowitym
wyzdrowieniu,  które  najczęściej  ma  miejsce  po  ok.  miesiącu,
obserwuje się nawrót choroby.

• Przewlekłe EAE z opóźnionym rozwojem - utrata wagi i ogólne

osłabienie w dwa tygodnie po immunizacji, z objawami
neurologicznymi rozpoczynającymi się miesiąc lub dwa miesiące
później.

•

EAE  jest  chorobą  wielogenową,  więc  podatność
oraz  przebieg  kliniczny  mogą  się  różnić  w
zależności  od  użytego  antygenu  (np.  MBP  lub  PLP)
oraz

szczepu/gatunku

zwierzęcia

wykorzystanego  do  badań.  Tak  więc  EAE  nie  jest
pojedynczym  modelem  choroby,  ale  wieloma
modelami,  które  wykazują  różnorodny  poziom
podobieństwa do MS.

Aktywny model EAE

• W aktywnym modelu EAE podatne szczepy

myszy

immunizowane

są

odpowiednim

antygenem

mielinowym

lub

białkiem

emulgowanym w kompletnym adjuwancie

Freund’a (CFA).

• Myszom zwykle podaje się również toksynę

pałeczki krztuśca (PT) w dniu immunizacji oraz

48h później. Uważa się, że PT odgrywa istotną

rolę w przełamaniu bariery krew-mózg.

• W zależności od wykorzystanego szczepu myszy

oraz rodzaju antygenu, EAE rozwija się 10 do

15 dnia po pierwszej immunizacji.

• Po aktywnej immunizacji zachorowalność wynosi

75% do 80%.

• Bardzo często po aktywnej immunizacji przebieg

choroby jest monofazowy. Istotnym wyjątkiem

jest aktywny model EAE indukowany w myszach

szczepu SJL lub (SJL × SWR) F1 z

wykorzystaniem PLP 139-151 emulgowanego w

CFA. W tym przypadku myszy rozwijają

nawracająco-ustępującą postać choroby, która

rozwija się bez użycia PT.

• Dawka i rodzaj immunizacji oraz szczep

wykorzystany do badań decydują o ciężkości

przebiegu indukowanej choroby, który może

wahać się od łagodnego do śmiertelnego.

• Nie wszystkie szczepy gryzoni są jednakowo podatne na

indukcję  EAE.  Klasycznymi  szczepami  podatnymi  na
immunizację MBP oraz PLP są szczury Lewisa i DA oraz
myszy  SJL/J  i  PL/J.  Immunizacja  MOG  wywołuje  EAE  u
kilku  dodatkowych  szczepów,  przede  wszystkim  u
szczurów  BN  i  u  myszy  C57BL/6  i  BALB/c,  które  są
odporne na immunizację MBP czy PLP.

• Aktywnie indukowane EAE nie dotyczy wyłącznie

gryzoni, można je wywoływać u naczelnych, np. u rezusa
czy  małpy  szerokonosej  (Callithrix  jacchus).  Tak  jak  u
gryzoni,  dawka,  rodzaj  autoantygenu  i  adjuwant
wykorzystane  do  immunizacji  decydują  o  charakterze
choroby.  Obecnie  większość  badań  nad  EAE  u
naczelnych

opartych

jest

immunizacji

rekombinowanym ludzkim MOG w CFA, co skutkuje
indukcją choroby neurologicznie i histologicznie
podobnej do ludzkiego MS.

Bierny model EAE

• W biernym modelu EAE jest indukowane poprzez wstrzyknięcie

do  myszy  aktywowanych  komórek  T  mielinospecyficznych.  Te
aktywowane  komórki  T  są  generowane  poprzez  immunizację
myszy  (donorów)  za  pomocą  białka  mieliny  lub  peptydu
emulgowanego w CFA. Węzły chłonne są usuwane, a komórki T
aktywowane  ponownie  in  vitro  przy  pomocy  odpowiedniego
antygenu. Tak aktywowane komórki T są przenoszone do myszy
(biorców), które następnie rozwijają EAE.

• Najczęściej w biernym modelu EAE stosuje się myszy SJL lub

(PL x SJL) F1 oraz białko MBP jako antygen indukujący. W tym
modelu EAE myszy rozwijają nawracająco-ustępującą formę
choroby.

• Po

uzyskaniu

linii

komórkowych

monospecyficznych

limfocytów T ze szczurów Lewis, a następnie z myszy, okazało
się, że autoimmunologicznymi komórkami efektorowymi
przenoszącymi EAE są limfocyty T pomocnicze (CD4+), które
rozpoznają autoantygenne epitopy białka w kontekście
determinant MHC klasy II.

• Wiele z tych komórek odpowiada na aktywację wydzielając

interferon-γ i TNF-α, ale nie IL-4 czy IL-5, i dlatego zostały
sklasyfikowane jako komórki Th-1.

• Niedawno odkryto jednak, że ta populacja zawiera szczególny

podzbiór komórek T CD4+, które wydzielały IL-17 zamiast
interferonu-γ , były to komórki Th17. Obecnie komórki T Th17
uznaje się za „prawdziwe” patogenne mediatory.

• Bierny model EAE był również wywoływany u naczelnych. Z krwi

małej grupy rezusów wyizolowano MBPspecyficzne komórki T, z
których stworzono linię komórkową. Te komórki były ponownie
aktywowane in vitro i wstrzyknięte do donora. W jednym przypadku
na trzy komórki T spowodowały łagodne zapalenie OUN.

• Transfer komórek T pomiędzy osobnikami nie hodowanymi wsobnie

nie przyniesie spodziewanych rezultatów z powodu niezgodności
tkankowej.

• Inaczej jest w przypadku małp szerokonosych, które rodzą się jako

bliźnięta  dzielące  to  samo  łożysko.  Rodzeństwo  posiada
immunologiczną  tolerancję  na  siebie  nawzajem,  co  pozwala  na
wzajemne  transplantacje  tkanek.  Kiedy  linia  komórek  T
mielinospecyficznych  wyprowadzona  od  jednego  z  bliźniąt  była
wprowadzana do drugiego, wywoływało to EAE.

Spontaniczny model EAE

• Dwa zespoły badawcze (Krishnamoorthy i wsp. oraz Bettelli i

wsp.) wyhodowały podwójnie transgeniczne myszy u których
ekspresji ulegają receptory komórek B i T rozpoznające to samo
białko mielinowe. Myszy te powstały ze skrzyżowania dwóch linii
transgenicznych.

• Pierwsza linia myszy transgenicznych została wygenerowana za

pomocą

technologii

knock-in,

poprzez

wstawienie

rekombinowanego

łańcucha

ciężkiego

demielinizacyjnego

przeciwciała anty-MOG w region J immunoglobuliny. Dzięki temu
uzyskano myszy których 20-30% krążących komórek B wytwarza
przeciwciała anty-MOG oraz wykazuje ekspresję receptora
(BCR) rozpoznającego białko MOG. Myszy te nazwano IgH

MOG

• Druga linia, nazwana TCR

MOG

, została stworzona poprzez

ekspresję

TCR,

który

rozpoznaje

immunodominującą

determinantę białka MOG. Myszy te spontanicznie rozwijały
zapalenie nerwu wzrokowego, typowy wczesny objaw MS.

• Ponad połowa z tych myszy w wieku 8 tygodni

spontanicznie rozwinęła autoimmunizacyjną
demielinizację w ich rdzeniu kręgowym i nerwach
wzrokowych, co jest symptomem przypominającym
ludzkie stwardnienie rozsiane.

• Krishnamoorthy i wsp. nazwali ten model OSE. W

rdzeniu kręgowym uszkodzenia znajdowały się przede
wszystkim pod oponą miekką, tak jak w aktywnym
modelu EAE. W przeciwieństwie do OSE, spontaniczne
EAE występuje w większości powszechnie
wykorzystywanych modeli tylko w niewielkim zakresie,
lub po ekspozycji na drobnoustroje ewentualnie poprzez
eliminację komórek regulatorowych.

• Badania nad OSE wykazały, że ostry przebieg EAE oraz

zachorowalność nie są zakłócane przez takie czynniki,
jak płeć czy warunki hodowli.

Patogeneza EAE

• Komórki T odgrywają istotną rolę w przełamaniu

bariery krew-mózg oraz w patogenezie EAE. Za
indukcję procesu autoimmunizacji w EAE
odpowiadają

aktywowane

autoreaktywne

limfocyty T CD4+ swoiste względem składników
mieliny,  wydzielające  IFN-γ,  IL-2,  TNF-β.  W
patogenezie  EAE  biorą  udział  również  limfocyty
Th2,  limfocyty  T  CD8+,  makrofagi,  limfocyty  B,
limfocyty Th17 i prawdopodobnie komórki NK.

• Eksperymentalne autoimmunologiczne zapalenie mózgu i

rdzenia rozwija się wskutek infiltracji OUN przez limfocyty
Th1 uwalniające cytokiny prozapalne (IFN-γ, IL-2, TNF-β)
oraz makrofagi.

• Autoreaktywne komórki T rozpoznają antygeny mieliny,

które  mogą  być  prezentowane  przez  okołonaczyniowe
makrofagi  bariery  krew-mózg.  Po  aktywacji  limfocyty  T
uwalniają  cytokiny  i  chemokiny,  które  zmieniają  ekspresję
molekuł adhezyjnych na otaczających komórkach, zwiększa
się  przepuszczalność  bariery  krew-mózg  i  dochodzi  do
rekrutacji komórek z krążenia do mózgu.

• Następstwem

autoimmunizacyjnego

zapalenia

jest

uszkodzenie mieliny i oligodendrocytów, jak również
aksonów, co prowadzi do utraty ich funkcji.

Podobieństwa i różnice między MS i

EAE

• Główną różnicą między MS i EAE jest to, że MS jest chorobą

spontaniczną, podczas gdy EAE jest indukowana poprzez

immunizację antygenami tkanki mózgowej.

• Ponadto, w większości protokołów, silny adjuwant jest

wykorzystywany do indukcji choroby. Nie wydaje się, że

podobnie silny immunologiczny czynnik występuje w

fizjologicznych warunkach, nawet w chorobach zakaźnych.

• Dla zapewnienia powtarzalności uzyskanych wyników, EAE

jest badane u osobników wsobnych lub homogennych

genetycznie. W ten sposób, genetyczna heterogenność,

która jest bardzo ważna w populacji osób ze stwardnieniem

rozsianym, jest odzwierciedlana tylko, kiedy różnorodne

modele EAE są badane równolegle.

• Podobnie jak w MS, EAE jest związane z wczesnym

naruszeniem bariery krew-mózg i ogniskowym przenikaniem

okołonaczyniowych jednojądrzastych komórek.

Model zwierzęcy

Podobieństwa do MS

Różnice z MS

Szczur Lewis

Aktywny model EAE

udział komórek T w

zapaleniu,słaba odpowiedź

przeciwciał

choroba jednofazowa, niewielka

demielinizacja

Bierny model EAE

udział komórek T w zapaleniu,

topografia choroby

choroba jednofazowa, niewielka

demielinizacja

Aktywny lub bierny model

EAE + wzajemny transfer

przeciwciał anty-MOG

udział komórek T w zapaleniu,

demielinizacja

tylko krótkotrwała demielinizacja

Szczur kongeniczny

Lewis, DA, BN

Aktywny model EAE

choroba nawracająco-ustępująca,

może naśladować histopatologię

nie jest chorobą spontaniczną

Mysie EAE

Aktywny model EAE

choroba nawracająco-ustępująca

lub przewlekła postępująca,

demielinizacja i uszkodzenie

aksonów

nie jest chorobą spontaniczną

Myszy transgeniczne lub

typu knockout

szczegółowe określenie roli

badanych molekuł

immunologicznych/ cytokin

neurotroficznych/ szlaków

neuroanatomicznych

sztucznie stworzone zwierzęta

transgeniczne lub knock out

• Miastenia

rzekomoporaźna

(MG)

jest

chorobą

autoimmunologiczną nerwowo-mięśniową, w której uczestniczą

przeciwciała skierowane przeciwko nikotynowym receptorom

acetylocholinowym (AChR). Przeciwciała po połączeniu się z

AChR aktywują kaskadę dopełniacza.

• Główny mechanizm zaangażowany w destrukcję AChR jest

związany z aktywnością przeciwciał i dopełniacza.

• Również wiązanie krzyżowe AChR przez przeciwciała prowadzi

do antygenowej modulacji i może przyczyniać się do

zredukowania liczby tych receptorów w płytce nerwowo-

mięśniowej (neuromuscular junction, NMJ).

• Niewielka liczba przeciwciał anty-AChR może również wiązać

się z AChR i w ten sposób może zakłócać przewodnictwo

nerwowo-mięśniowe.

• Powyższe zjawiska patologiczne mogą prowadzić do defektów

w przekaźnictwie nerwowo-mięśniowym, objawiających się

osłabieniem i zmęczeniem mięśni szkieletowych u pacjentów z

MG.

• Eksperymentalna

autoimmunologiczna

miastenia

rzekomoporaźna zazwyczaj jest indukowana poprzez
immunizację

zwierząt

pomocą

AChR

drętwy

kalifornijskiej  lub  węgorza  elektrycznego  z  adjuwantem.
EAMG  może  być  również  indukowana  u  szczurów  i  myszy
poprzez  podanie  surowicy  od  gryzoni  z  EAMG  lub  od
pacjentów,

lub

poprzez

podanie

przeciwciał

monoklonalnych lub poliklonalnych przeciwko AChR.

Model aktywny EAMG

• W modelu aktywnym EAMG króliki, szczury i myszy

immunizowane są rybim, szczurzym, mysim lub ludzkim
AChR emulgowanym w CFA i rozwijają przewlekłą
postać EAMG, która w dużym stopniu przypomina ludzką
MG.

• W przewlekłej EAMG, typowe cechy patologiczne są

bardzo podobne do tych obserwowanych w MG i
obejmują redukcję

NMJ, znaczny spadek zawartości

AChR na błonie postsynaptycznej oraz odkładanie się
IgG i dopełniacza w NMJ.

• W tej formie EAMG nie obserwuje się żadnej znacznej

infiltracji komórkowej w lub blisko NMJ.

• Immunizacja szczurów Lewis za pomocą AChR w CFA

razem z toksyną pałeczki krztuśca (PT) prowadzi do
indukcji ostrej postaci EAMG, 7-11 dni po immunizacji,
charakteryzującej

się

odkładaniem

przeciwciał

dopełniacza oraz inwazją komórek fagocytarnych do NMJ.

• Małpy również rozwijają EAMG poprzez immunizację

AChR. Co jest ważne, małpy z EAMG wykazują
charakterystyczne opadanie powiek często obserwowane
w ludzkiej MG, natomiast nieobecne u gryzoni.

Model bierny EAMG

• EAMG może być również efektywnie indukowane u

gryzoni  poprzez  bierny  transfer  patogennych  przeciwciał
(np.  podanie  przeciwciał  monoklonalnych  skierowanych
przeciwko  głównemu  regionowi  immunogennemu  (MIR)
AChR) lub poprzez podanie surowicy zwierząt z EAMG.

• Bierny transfer EAMG z użyciem przeciwciał może

powodować osłabienie mięśniowe w ciągu 1 dnia. Próbki
mięśni

wykazały

infiltrację

NMJ

przez

komórki

jednojądrzaste,  podobnie  jak  w  ostrej  postaci  EAMG
indukowanej  przez  szczepienie  receptorem  ACh  i  PT.
Podobnie  do  modelu  ostrej  EAMG,  bierny  model  nie  jest
dokładnym

odzwierciedleniem

ludzkiej

miastenii

reprezentuje tylko efektorowy (czynny) etap choroby.

Patogeneza EAMG

• W EAMG i MG, wytwarzanie przeciwciał przeciwko AChR

jest zależne od komórek T i B.

• Różnorodne cytokiny wspomagają rozwój odpowiedzi

immunologicznej przeciwko AChR poprzez indukcję

ekspresji molekuł kostymulujących, dojrzewania komórek

T i B oraz produkcji przeciwciał i dopełniacza.

• Co ciekawe, zarówno cytokiny typu Th1, jak i Th2

odgrywają ważną rolę w indukcji EAMG i nieprawidłowe

funkcjonowanie jednego z tych systemów sprawia, że

myszy są bardzo odporne na indukcję choroby.

• Przeciwciała anty-AChR aktywują kaskadę dopełniacza i

formowanie

kompleksu

atakującego

błonę

(MAC),

wzmagając destrukcję NMJ pierwotnie dokonywaną przez

przeciwciała anty-AChR.

• Pomimo, że komórkowa infiltracja tkanki mięśniowej

wydaje się być istotnym czynnikiem przyczyniającym się do
rozwoju  osłabienia  mięśniowego  w  ostrej  postaci  EAMG  u
gryzoni,  niewielkie  ilości  komórek  są  obserwowane  w
tkance mięśniowej przewlekłej postaci EAMG u gryzoni czy
ludzkiej  MG.  Prawdopodobnie,  w  przewlekłej  postaci
EAMG,  komórki  jednojądrzaste  wspomagają  indukcję
osłabienia

mięśniowego

nie

poprzez

bezpośrednie

uszkodzenie komórek mięśniowych czy NMJ, ale poprzez
pomoc w wytworzeniu silnej odpowiedzi komórek T i B
przeciwko AChR.

Podobieństwa i różnice między

EAMG i MG

• Podobieństwa:

- uogólnione osłabienie mięśniowe i męczliwość
zmieniające się w ciągu dnia
- predyspozycja genetyczna przynajmniej częściowo
kontrolowana przez cząsteczki MHC klasy II
-

zmniejszenie

amplitudy,

ale

nie

częstości

miniaturowych potencjałów płytki nerwowo-mięśniowej
- słabnąca odpowiedź na powtarzające się stymulacje
- zmniejszająca się wrażliwość na acetylocholinę
- przeciwciała anty-AChR, dopełniacz C3, MAC, IgG w
NMJ
- utrata AChR w płytce nerwowo-mięśniowej
- choroba immunologiczna związana z komórkami T i B

Document Outline