OZNACZENIE ILO CIOWE
W HPLC
Dr in . Agata Kot-Wasik
Katedra Chemii Analitycznej,
Wydział Chemiczny ,
Politechnika Gda
ń
ska
OZNACZENIE ILO CIOWE
W HPLC
Dr in . Agata Kot-Wasik
Katedra Chemii Analitycznej,
Wydział Chemiczny ,
Politechnika Gda
ń
ska
CEL
•
Celem rozdzielania mieszaniny substancji na poszczególne
składniki, b d rozdzielenia tylko wybranych substancji od
innych, jest najcz ciej ich ilo ciowe oznaczenie, tj.
ustalenie zawarto ci lub masy w analizowanej próbce
.
•
Wysokosprawna chromatografia cieczowa (HPLC) jest
wykorzystywana do oznaczenia zawarto ci
składników głównych
wyst
ę
puj
ą
cych w próbce na poziomie
st
ę
Ŝ
e
ń
w zakresie od 1 do 100 %,
składników po rednich
– od 0.001 do 1%
składników ladowych
substancji
obecnych w analizowanej
próbce poni
Ŝ
ej 0.001%
Oznaczenie ilo ciowe w HPLC
polega na ustaleniu zale no ci pomi dzy
sygnałem detektora, czyli powierzchni
pod pikiem lub ewentualnie wysoko ci
piku, a st eniem lub mas składnika,
którego zawarto zamierzamy
oznaczy
.
WARUNEK OZNACZENIA ILO CIOWEGO:
1.
rozdzielenie zwi zków do podstawy
2.5
5
7.5
10
0
50000
100000
150000
200000
250000
300000
350000
400000
450000
2.
POWIERZCHNIA CZY WYSKO
?
238 nm
254 nm
Dzisiaj
Jutro ?
Powierzchnia (A) = const.
Wysoko (H) = const.
11
11.5
12
12.5
13
13.5
14
14.5
15
15.5
16
100
200
300
400
500
600
700
800
0
2000
4000
6000
8000
cz
as
m/z
in
te
n
s
yw
n
o
ś
ć
s
yg
n
a
łu
WARUNEK OZNACZENIA ILO CIOWEGO:
3.
Zawsze dokonuje si dla tej samej (wybranej)
długo ci fali
Metody oznaczania ilo ciowego:
•
z punktu
•
metoda wzorca zewn trznego (metoda
krzywej kalibracyjnej),
•
metoda wzorca wewn trznego,
•
metoda dodatku wzorca (metoda fortyfikacji)
•
metoda prostej normalizacji lub normalizacji
ze współczynnikami korekcyjnymi
Metoda tzw. z punktu
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
0
1
2
3
4
5
S
t
ę
Ŝ
e
n
i
e
a
n
a
l
i
t
u
[
m
g
/
m
L
]
P
o
w
i
e
r
z
c
h
n
i
a
/
w
y
s
o
k
o
ś
ć
p
i
k
u
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
0
1
2
3
4
5
S
t
ę
Ŝ
e
n
i
e
a
n
a
l
i
t
u
[
m
g
/
m
L
]
P
o
w
i
e
r
z
c
h
n
i
a
/
w
y
s
o
k
o
ś
ć
p
i
k
u
Z dwóch punktów ?
Metoda wzorca zewn trznego
metoda krzywej kalibracyjnej
external standard
Istot metody wzorca zewn trznego jest wyznaczenie
zale no ci pomi dzy powierzchni (wysoko ci ) piku
dla ka dej z oznaczanych substancji i ich st eniem lub
mas .
Metoda wzorca zewn trznego
metoda krzywej kalibracyjnej
external standard
•
W tym celu przygotowuje si
ę
roztwory kalibracyjne, tzn. roztwory substancji
oznaczanej albo mieszaniny analizowanych substancji w kilku ró
Ŝ
nych
st
ę
Ŝ
eniach . . . .
Metoda wzorca zewn trznego
metoda krzywej kalibracyjnej
external standard
•
W tym celu przygotowuje si
ę
roztwory kalibracyjne, tzn. roztwory substancji
oznaczanej albo mieszaniny analizowanych substancji w kilku ró
Ŝ
nych
st
ę
Ŝ
eniach i
ka
Ŝ
dy z przygotowanych roztworów dozowany jest do kolumny
chromatograficznej
.
Metoda wzorca zewn trznego
metoda krzywej kalibracyjnej
external standard
•
. . . Na podstawie powierzchni lub wysoko
ś
ci pików, na uzyskanych
chromatogramach wyznacza si
ę
przebieg krzywej kalibracyjnej b
ą
d
ź
oblicza
si
ę
warto
ś
ci współczynników w równaniu kalibracyjnym dla ka
Ŝ
dej z
oznaczanych substancji.
p
o
w
ie
rzc
h
n
ia
p
iku
y = 10,2x - 0,4
R
2
= 0,9989
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
0
1
2
3
4
5
S
t
ę
Ŝ
e
n
i
e
a
n
a
l
i
t
u
[
m
g
/
m
L
]
P
o
w
i
e
r
z
c
h
n
i
a
/
w
y
s
o
k
o
ś
ć
p
i
k
u
Metoda wzorca zewn trznego
metoda krzywej kalibracyjnej
external standard
•
Nast
ę
pnie dozowane do kolumny i rozdzielane s
ą
próbki, w których oznaczona
ma by
ć
zawarto
ś
ć
wybranych substancji.
Metoda wzorca zewn trznego
metoda krzywej kalibracyjnej
external standard
•
Uzyskane powierzchnie pików
substancji oznaczanych w
nieznanej próbce umo
Ŝ
liwi
ą
oznaczenie ich zawarto
ś
ci, tj.
st
ę
Ŝ
enia (masy).
2.5
5
7.5
10
0
50000
100000
150000
200000
250000
300000
350000
400000
450000
p
o
w
ie
rzc
h
n
ia
p
iku
y = 10,2x - 0,4
R
2
= 0,9989
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
0
1
2
3
4
5
S
t
ę
Ŝ
e
n
i
e
a
n
a
l
i
t
u
[
m
g
/
m
L
]
Cx
Cx
P
o
w
i
e
r
z
c
h
n
i
a
/
w
y
s
o
k
o
ś
ć
p
i
k
u
Warunki poprawnego stosowania
metody wzorca zewn trznego
•
zarówno roztwory wzorcowe, jak i analizowane próbki
musz
by rozdzielane ("chromatografowane") w tych
samych warunkach temperatury, obj to ciowego nat enie
przepływu eluentu, typu i wymiarów kolumny
chromatograficznej, z reguły tej samej kolumny, składu
eluentu oraz takiego samego programu elucji.
UWAGA !
Ekstrapolacja
przebiegu krzywej kalibracyjnej poza zakres
wykonanej kalibracji, mo e by ródłem niedokładnych
wyników oznacze ze wzgl du na nieliniowy przebieg
odpowiedzi detektora !
p
o
w
ie
rzc
h
n
ia
p
iku
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
0
1
2
3
4
5
S
t
ę
Ŝ
e
n
i
e
a
n
a
l
i
t
u
[
m
g
/
m
L
]
Cx
Cx
P
o
w
i
e
r
z
c
h
n
i
a
/
w
y
s
o
k
o
ś
ć
p
i
k
u
Metoda wzorca wewn trznego
internal standard
Jest to metoda polegaj ca na dodaniu do próbki znanej ilo ci
składnika, tzw. wzorca wewn trznego (IST), który jest
jednak inny od substancji oznaczanych i nie mo e by
obecny w analizowanych próbkach przed jego dodaniem.
•
W celu uzyskania krzywej kalibracyjnej do kilku roztworów
wzorcowych o ró
Ŝ
nych st
ę
Ŝ
eniach substancji oznaczanej dodaje si
ę
najcz
ę
ś
ciej stał
ą
i znan
ą
ilo
ś
ć
wzorca wewn
ę
trznego. Na podstawie
uzyskanych chromatogramów roztworów wzorcowych wykre
ś
la
si
ę
zale
Ŝ
no
ś
ć
st
ę
Ŝ
enia analitu w funkcji stosunku powierzchni piku
analitu i wzorca wewn
ę
trznego.
y = 10,2x - 0,4
R
2
= 0,9989
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
0
1
2
3
4
5
S
t
ę
Ŝ
e
n
i
e
a
n
a
l
i
t
u
[
m
g
/
m
L
]
Cx
Cx
p
o
w
ie
rzc
h
n
ia
p
iku
S
t
o
s
u
n
e
k
p
o
w
i
e
r
z
c
h
n
i
/
w
y
s
o
k
o
ś
c
i
p
i
k
u
a
n
a
l
i
t
u
i
w
z
o
r
c
a
w
e
w
n
ę
t
r
z
n
e
g
o
Wymagania dotycz ce wzorca
wewn trznego
•
musi by
ć
rozdzielony od innych składników wyst
ę
puj
ą
cych w próbce
•
czas retencji powinien by
ć
zbli
Ŝ
ony do czasu retencji analitu(ów)
•
nie wyst
ę
puje w próbkach pierwotnych
•
wła
ś
ciwo
ś
ci fizyko-chemiczne s
ą
podobne do analitu. Jest to
szczególnie istotne na etapie przygotowania próbek (oczyszczania,
wzbogacania czy derywatyzacji)
•
powinien by
ć
mo
Ŝ
liwie wysokiej czysto
ś
ci
•
stabilny chemicznie
•
odpowied
ź
detektora dla wzorca wewn
ę
trznego powinna by
ć
zbli
Ŝ
ona
do odpowiedzi substancji oznaczanych
Metoda wzorca wewn trznego
•
ma zastosowanie szczególnie w przypadku metod
analitycznych wymagaj cych zło onej, wieloetapowej
procedury przygotowania próbki (izolacja, wzbogacanie,
derywatyzacja itp.), co mo e powodowa straty analitów
•
pozwala równie na uniezale nienie otrzymywanych
wyników od waha ilo ci dozowanej próbki
•
w praktyce metoda ta jest te bardziej pracochłonna ni
metoda krzywej kalibracyjnej
WARUNEK OZNACZENIA ILO CIOWEGO:
rozdzielenie zwi zków do podstawy
A JE LI NIE DO PODSTAWY ???
2.5
5
7.5
10
0
50000
100000
150000
200000
250000
300000
350000
400000
450000
Metoda dodatku wzorca
standard addition
Metoda ta polega na dodaniu do próbki znanych ilo ci
substancji oznaczanych (analitów), zwykle jest to
od 50 do
150%
oczekiwanej zawarto ci oznaczanej substancji.
Po zanalizowaniu tych roztworów, na podstawie uzyskanych
chromatogramów, wykre la si krzywe kalibracyjne, tj.
zale no powierzchni piku analitu w funkcji ilo ci analitu
dodanej do próbki .
y = 120x + 22,5
R
2
= 0,9931
0
10
20
30
40
50
60
70
80
0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
I
l
o
ś
ć
a
n
a
l
i
t
u
d
o
d
a
ne
g
o
d
o
p
r
ó
b
k
i
[
m
g
/
m
L
]
p
o
w
ie
rzc
h
n
ia
p
iku
P
o
w
i
e
r
z
c
h
n
i
a
/
w
y
s
o
k
o
ś
c
p
i
k
u
Metoda dodatku wzorca c.d.
Nast pnie przeprowadza si graficzn ekstrapolacj
krzywej kalibracyjne do punkt przeci cia z osi
odci tych i odczytuje si warto c
x
y = 120x + 22,5
R
2
= 0,9931
0
10
20
30
40
50
60
70
80
-0,2
-0,1
0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
I
l
o
ś
ć
a
n
a
l
i
t
u
d
o
d
a
ne
g
o
d
o
p
r
ó
b
k
i
[
m
g
/
m
L
]
Cx
Cx
p
o
w
ie
rzc
h
n
ia
p
iku
P
o
w
i
e
r
z
c
h
n
i
a
/
w
y
s
o
k
o
ś
c
p
i
k
u
Metoda dodatku wzorca c.d.
Innym sposobem okre lenia zawarto ci substancji
oznaczanej w próbce bez dodatku wzorca jest
graficzne wyznaczenie przebiegu nowej linii
kalibracyjnej typu f(x)=a
1
x, o tym samym
współczynniku nachylenia prostej, co krzywa
kalibracyjna.
y = 120x + 22,5
R
2
= 0,9931
0
10
20
30
40
50
60
70
80
-0,2
-0,1
0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
I
l
o
ś
ć
a
n
a
l
i
t
u
d
o
d
a
ne
g
o
d
o
p
r
ó
b
k
i
[
m
g
/
m
L
]
Cx
Cx
p
o
w
ie
rzc
h
n
ia
p
iku
P
o
w
i
e
r
z
c
h
n
i
a
/
w
y
s
o
k
o
ś
c
p
i
k
u
Metoda prostej normalizacji
Metoda prostej normalizacji nie jest metod kalibracji.
Nie stosuje si w niej odniesienia do znanej ilo ci wzorca.
Metoda ta umo liwia oszacowanie wzgl dnych ilo ci
substancji np. zawarto ci zanieczyszcze w badanej
próbce.
Na podstawie chromatogramu oblicza si sumaryczn
powierzchni pików, któr traktuje si jak 100% ...
A
1
A
3
A
2
A
4
A
1
+A
2
+A
3
+A
4
= 100%
1%
51%
1%
47%
a nast pnie oblicza si udział powierzchni okre lonego piku
wzgl dem sumy powierzchni wszystkich lub tylko
wybranych pików na chromatogramie.
Metoda prostej normalizacji opiera si na zało eniu,
e współczynniki odpowiedzi dla ka dego składnika
próbki s takie same, tzn. takie same st enia ró nych
substancji odpowiadaj takim samym powierzchniom
ich pików chromatograficznych.
ALE ...
Tak charakterystyk cechuje si detektor FID
stosowany w chromatografii gazowej do oznaczania
w glowodorów.
W chromatografii cieczowej metoda uproszczonej
normalizacji nie ma zastosowania.
Detektory stosowane w HPLC charakteryzuj si
zró nicowan czuło ci wzgl dem substancji.
Korzystne mo e by stosowanie metody prostej
normalizacji, gdy wykorzystywany jest
detektor
refraktometryczny
lub
detektor wiatła
rozproszonego
. Detektory te wykazuj zbli on
odpowied dla ró nych substancji o zbli onej
strukturze i masie cz steczkowej.
Metoda normalizacji ze
współczynnikami korekcyjnymi
Metoda ta polega na okre leniu wzgl dnej powierzchni
piku substancji badanej wzgl dem wybranych b d
wszystkich pików na chromatogramie
z uwzgl dnieniem
współczynników korekcyjnych, uwzgl dniaj cych
zró nicowan odpowied detektora dla ró nych
składników próbki.
Na chromatogramie mieszaniny o znanych
zawarto ciach substancji badanych oblicza si pola
powierzchni pików, a nast pnie oblicza si wzgl dny
udział procentowy poszczególnych substancji metod
prostej normalizacji. W dalszej kolejno ci oblicza si
warto współczynnika korekcyjnego dla danej
substancji korzystaj c z równania
Wyznaczanie współczynników korekcyjnych
)
(
)
(
obliczone
c
znane
c
R
i
i
fi
=
c
i
(znane) – zawarto
ś
ć
składnika i w roztworze wzorcowym,
c
i
(obliczone) – udział składnika i w rozworze wzorcowym obliczony metod
ą
prostej normalizacji
Dzi kuj za uwag .