Wydzia³ Chemiczny Politechniki Gdañskiej

Wydział Chemiczny Politechniki Gdańskiej

Katedra Technologii Leków i Biochemii

Kultury tkankowe i komórkowe roślin i zwierząt

PORÓWNANIE ILOŚCI I JAKOŚCI DNA WYIZOLOWANEGO Z KOMÓRKI

ROŚLINNEJ I ZWIERZĘCEJ

METODY BADANIA KWASÓW NUKLEINOWYCH:

1. TECHNIKI MIKROSKOPOWE

A. MIKROSKOPIA ELEKTRONOWA

Mikroskop elektronowy jest urządzeniem, którego zakres rozdzielczości wynosi

0,2-20 nm, co umożliwia oglądanie organelli komórkowych, wirusów i
makrocząsteczek biologicznych (np. DNA), niemniej jednak ograniczeniem
mikroskopu elektronowego jest brak możliwość oglądania próbek materii żywej.

Najbardziej popularną techniką uwidaczniania DNA jest metoda Klein-Schmidta.

W tej technice kroplę roztworu DNA w octanie amonu zawierającym cytochrom c,
nanosi się na powierzchnię octanu amonu. Po dotknięciu przez kroplę powierzchni,
tworzy się na niej cienki film zdenturowanego cytochromu c. Film ten zawiera pewną
ilość cząsteczek DNA, do której przyłącza się cienka warstwa cytochromu. Jeżeli do
tego filmu zostanie przyłożony mały obiekt kulisty, to dołączy się do niego kropla
zawierająca część filmu. Usunięcie fazy wodnej np. poprzez zanurzenie w alkoholu,
spowoduje stabilne przyleganie warstwy do filmu pokrywającego kulisty obiekt.
Technika ta zawiera wstępne barwienie pozytywne, np. octanem uranu. Metoda ta jest
stosowana do określania długości i formy DNA. Zmodyfikowana metoda Klein-
Schmidta pozwala natomiast zlokalizować specyficzne obszary w DNA m.in. określić
pozycje końców liniowego DNA w formie kolistej, identyfikować bardzo długie
cząsteczki izolowane z E.coli zainfekowanych fagiem

λ oraz określić kierunek

replikacji DNA faga

λ.

B. SKANINGOWA MIKROSKOPIA ELEKTRONOWA

Skaningowa mikroskopia elektronowa pozwala na badanie cech strukturalnych

obiektów biologicznych o wymiarach 3-20 nm w buforach czy w warunkach
zbliżonych do fizjologicznych. Znalazła ona zastosowanie w badaniach nad zginaniem
DNA na skutek różnych oddziaływań z białkami, oddziaływaniem przeciwciał z
różnymi formami DNA, w analizie relacji stechiometrycznych kompleksów białek z
kwasami nukleinowymi i badaniach struktury chromatyny.

C. MIKROSKOPIA SKANINGOWO-TUNELOWA

Mikroskopia skaningowo-tunelowa jest precyzyjną techniką charakteryzującą się

wysoką rozdzielczością - co najmniej 0,02

×0,3 nm, pozwalająca uzyskiwać obraz

trójwymiarowy. Za pomocą mikroskopu skaningowo-tunelowego bada się m.in.
kompleksy białek z kwasami nukleinowymi oraz topografię DNA.

2. ELEKTROFOREZA

Elektroforeza jest obecnie jedna z głównych metod identyfikacji, rozdzielania i

oczyszczania kwasów nukleinowych. W wersji podstawowej jest to prosta i szybka
technika używana do rozdzielania cząsteczek DNA, które nie mogą być rozdzielone
innymi technikami np. przez wirowanie w gradiencie gęstości.

Do fizycznego opisu elektroforezy służą takie parametry jak: wielkość

molekularna DNA - N

, średnia wielkość porów w żelu -

α, natężenie pola

elektrycznego -

ε;

;

≡

gdzie M

jest wielkością fragmentów DNA, które „pasują” do typowej wielkości porów

żelu

= M

– ładunek cząsteczki o wielkości scharakteryzowanej przez M

A. ELEKTROFOREZA W ŻELU AGAROZOWYM

Agaroza to frakcja agaru oczyszczona z krasnorostów. Jest to polisacharyd

zbudowany z około 800 liniowo połączonych reszt heksozy (inaczej – 400 reszt
agarobioza). Agarobioza jest dwucukrem zbudowanym z D-galaktozy i 3,6-anhydro-L-
galaktozy. Powstawanie żelu agarozowego jest reakcją odwracalną, w wyniku której
pojedyncze, losowo zwinięte łańcuchy układają się w dwuniciową, helikalną strukturę
III-rzędową, które rozgałęziają się tworząc sieć. Wielkość porów żelu agarozowego
zależy od stężenia agarozy i określa zakres ciężaru makrocząsteczek np. DNA, RNA,
które można w niej elektroforetycznie rozdzielać.

Żel agarozowy stosuję się do rozdzielania DNA o szerokim zakresie mas

cząsteczkowych. Wadą elektroforezy w żelu agarozowym jest słaba rozdzielczość
frakcji DNA różniącego się poniżej 5% wielkości.

Stężenie agarozy [%] Zakres długości rozdzielanego liniowego DNA [kp.z]

0,3
0,6
0,7
0,9
1,2
1,5
2,0

5-60
1-20

0,8-10

0,5-7
0,4-6
0,2-3
0,1-2

Elektroforeza w żelu agarozowym prowadzona jest w aparatach ustawionych poziomo, a rozdział

elektroforetyczny prowadzony jest w buforze TBE

×1 (90 mM Tris-base, 90 mM kwas borowy, 2 mM

EDTA, pH 8) lub TAE

×1 (40 mM Tris-base, 40 mM lodowy kwas octowy, 1 mM EDTA, pH 8).

Cząsteczka DNA jest naładowana ujemnie w środowisku obojętnym i alkalicznym, a więc

umieszczona w polu elektrycznym, przemieszcza się w kierunku anody. DNA o tych samych masach
cząsteczkowych, ale różnych konformacjach charakteryzuje różna ruchliwość elektroforetyczna. Im
dłuższa jest cząsteczka DNA lub RNA tym dłużej odnajduje ona drogę poprzez pory żelu. Jeżeli
umieścimy DNA w żelu agarozowym i przyłożymy niskie napięcie to prędkość migracji DNA o różnych
ciężarach cząsteczkowych jest proporcjonalna do napięcia. Aby otrzymać optymalny rozdział DNA o
wielkości większej niż 2 kp.z, elektroforeza prowadzona jest w polu elektrycznym o natężeniu nie
większym niż 5V/cm. Powyżej tego napięcia fragmenty DNA przemieszczają się z prędkością
odwrotnie proporcjonalną do logarytmu ich ciężaru cząsteczkowego. Elektroforetyczne zachowanie
DNA w żelu agarozowym nie zależy od składu zasad azotowych i słabo zależy od temperatury. Jednak

jeżeli stosuje się żele agarozowe o stężeniu mniejszym niż 0,5% należy elektroforezę prowadzić w
temperaturze około 4

°C.

Do uwidocznienia DNA po lub w trakcie elektroforezy stosowany jest rutynowo bromek etydyny

(EtBr), który interkaluje pomiędzy sąsiednie pary dwuniciowego DNA (powinowactwo EtBr do
jednoniciowego DNA jest znacznie słabsze). Należy pamiętać, że obecność związku interaklującego do
DNA w żelu agarozowym zmniejsza ruchliwość elektroforetyczną DNA o około 15%. Innym
barwnikiem DNA jest np. SYBR Green, którego czułość barwienia dwuniciowego DNA jest około 25
razy większa niż EtBr.

B. ELEKTROFOREZA W ŻELU POLIAKRYLAMIDOWYM (PAGE)

Elektroforeza w żelu poliakrylamidowym jest wykorzystywana do rozdzielania i analizy małych

fragmentów DNA lub białek. Najlepszy rozdział uzyskuje się dla DNA o długości mniejszej niż 1000
par zasad. W żelach tych można efektywnie rozdzielać także jednoniciowe fragmenty DNA i RNA.
Żel poliakrylamidowy powstaje w wyniku polimeryzacji N,N’-metylenobisakrylamidu z monomerami
akryloamidu w obecności wolnych rodników dostarczonych przesz nadsiarczan amonu i
stabilizowanych przez TEMED (N,N,N’,N’-tetrametylenodiamina). Stopień usieciowana żelu (udział
procentowy N,N’-metylenobisakrylamidu) stanowi czynnik wpływający na rozdzielenie fragmentów
jednoniciowego DNA.

Elektroforezę w żelach poliakrylamidowych prowadzona jest w aparaturze

ustawionej pionowo, a więc migracja cząsteczek DNA jest zgodna z kierunkiem siły
ciążenia, gdzie jednoniciowe DNA charakteryzują się spowolnioną, w stosunku do
dwuniciowego DNA, migracja w żelu. Rozdział elektroforetyczny prowadzony jest w
buforze TBE

×1. DNA w żelu poliakrylamidowym można wybarwiać za pomocą np.

EtBr lub Sybr Gold.

Stężenie poliakrylamidu [%] Zakres długości rozdzielanego liniowego DNA [kp.z]

3,5
5,0
8,0

12,0
15,0
20,0

1000-2000

80-500
60-400
40-200
25-150

6-100

Żele poliakrylamidowe mają przewagę nad żelami agarozowymi z kilku przyczyn:

- zdolność rozdzielcza żeli poliakrylamidowych jest tak duża, że można rozdzielać

cząsteczki DNA różniące się o 1 p.z.

- studzienkę żelu poliakrylamidowego można załadować znacznie większą ilością

DNA niż w żelu agarozowym

- DNA odzyskany z żelu poliakrylamidowego jest czysty (nie wymaga dodatkowego

czyszczenia przy stosowaniu w biologii molekularnej)

C. ELEKTROFOREZA W POLU PULSYJĄCYM (PFGE)

Elektroforeza w polu pulsującym jest stosowana do rozdzielania fragmentów DNA o bardzo

dużej masie cząsteczkowej, np. DNA chromosomalnego wyższych eukariota, którego długość wynosi
powyżej 7000 p.z. W metodzie tej zastosowano zmienne, pulsujące, wzajemnie prostopadłe pole
elektryczne. Cząsteczki DNA znajdujące się w żelu, do którego zostanie przyłożone takie pole,
potrzebuje czasu aby zmienić swoje ułożenie na zgodne z orientacją pola. Czas ten jest tym dłuższy im
większa jest masa cząsteczki, a DNA będzie rozdzielana według masy, ponieważ czas trwania impulsu
elektrycznego jest krótszy niż czas potrzebny na reorientacje cząsteczki DNA w żelu. Granica
rozdzielczości elektroforezy w pulsującym polu elektrycznym zależy m.in. od stopnia jednorodności
stosowanych pól elektrycznych, długości trwania impulsu, względnych wartości natężenia obydwu pól.

D. ELEKTROFOREZA W POLU INWERSYJNYM (FIGE)

Elektroforeza w polu inwersyjnym jest stosowana do rozdzielania fragmentów DNA o długości

20-2000 p.z., przy czym rozdzielczość tej metody jest około 100-krotnie wyższa niż w przypadku
zwykłej elektroforezy agarozowej. Zastosowano tu elektryczne pole inwersyjnym którego wektor
natężenia pola zmienia zwrot na przeciwny w określonych momentach. Stosunek czasu trwania impulsu
dodatniego do ujemnego wynosi 3:1, a wartości bezwzględne natężenia pola obydwu impulsów są
równe. Podczas elektroforezy w polu inwersyjnym łańcuchy DNA ulegają cyklicznym, synchronicznym
zmianom konformacyjnym, które trwają do chwili zmiany zwrotu wektora natężenia pola elektrycznego
na przeciwny.
E. ELEKTROFOREZA KAPILARNA (CE)

Elektroforeza kapilarna jest stosowana do analizy krótkich, jednoniciowych oligonukleotydów

oraz sekwencjonowania DNA. W elektroforezie kapilarnej stosuje się kolumny (kapilary), których
wewnętrzna średnica wynosi najczęściej 50-100

µm, natężenie prądu 10-20 µA, a natężenie pola

elektrycznego w żelu około 300 V/cm przy zastosowaniu buforu o niskiej przewodności. W tej
elektroforezie wykorzystano efekt elektrosomozy. Kapilary wykonane są ze stopionej krzemionki, która
zawiera wolne grupy silanolowe ulegające jonizacji pod wpływem działania elektrolitu o pH

<2, na

skutek czego wewnętrzna powierzchnia kapilar zostaje naładowana ujemnie, a gęstość jej ładunku
zależy od pH. Przylegająca warstwa jonów dodatnich z roztworu znajdującego się w kapilarze po
przyłożeniu pola elektrycznego porusza się, powodując przepływ cieczy z zewnętrznego zbiornika przez
kapilary. Detekcja odbywa się najczęściej przez monitorowanie absorbancji UV na kolumnie. Objętość
próbki jest rzędu nanolitrów, co pozwala analizować składniki pojedynczych komórek.

F. ELEKTROFOREZA W ŻELACH DENATURUJĄCYCH (CGGE)

Elektroforeza w żelach denaturujących jest głównie wykorzystywana do

wykrywania i analizy mutacji. Wykorzystuje się tu fakt, że temperatura topnienia
wiązań wodorowych między zasadami azotowymi DNA zależy od składu zasad
komplementarnych nici. Stosuje się tu czynnik denaturujący, głównie mocznika lub
formamidu. Elektroforeza prowadzona jest w temperaturze bliskiej temperaturze
topnienia danego DNA, zazwyczaj w 55-60

°C. Temperatura topnienia DNA zależy od

składu ilościowo puryn i pirymidyn w DNA (temperatura topnienia dla G i C jest
wyższa niż dla A i T).

3. SPEKTROSKOPIA ABSORPCYJNA

W pomiarach spektroskopowych zasadnicze znaczenie ma znajomość stężeń

molowych kwasów nukleinowych. Stężenie można otrzymać z pomiaru absorpcji przy
długości

fali

λ = 260 nm (maksymalna absorpcja promieniowania nadfioletowego przez DNA),
jeżeli znamy molowy współczynnik ekstynkcji

ε:

•

260

gdzie l – to długość drogi optycznej w kuwecie. Przyjmuje się, ze wartości współczynnika ekstynkcji
wynosi 6600 M

-1

Widmo absorpcji może być wykorzystane do określenia stężenia i czystości próbki DNA. Pomiar

stężenia DNA w roztworze oznacza się poprze pomiar absorpcji przy długości fali

λ = 260 nm,

określanej często jako OD – gęstość optyczna. Idealny roztwór do pomiarów spektrofotometrycznych
DNA to bufor o niskim stężeniu jonów, np. bufor TE. Jeżeli A

260

równa się 1 to stężenie dwuniciowego

DNA (dsDNA) wynosi około 50

µg/ml, jednoniciowego DNA (ssDNA) 36 µg/ml, RNA - 40 µg/ml, a

oligonukleotydów 30

µg/ml. Należy jednak pamiętać, że jest to wartość przybliżona, ponieważ wartość

współczynnika ekstynkcji zależy od składu zasad azotowych w DNA. Stosunek A

260

280

jest natomiast

często stosowna miarą czystości roztworu DNA, a ściślej miarą zanieczyszczenia DNA białkami
(maksimum absorpcji UV dla białek wynosi 280 nm). Ogólnie preparat DNA uznaje się za czysty jeżeli
A

260

280

wynosi 1,8-2,0. Jeżeli próbka DNA zanieczyszczona jest RNA to wartość A

260

280

jest

bliższa 2,0, natomiast jeżeli próbka zanieczyszczona jest białkami to wartość A

260

280

jest niższa niż

1,8. Absorpcja mierzona przy długości fali 230 odzwierciedla zanieczyszczenia pochodzące od
węglowodorów, białek lub fenolu. W przypadku czystych próbek wartość A

260

230

powinna wynosić

2,2. Absorpcja mierzona przy długości fali 325 nm może być wyznacznikiem wytrąceń w roztworze lub
zanieczyszczeń samej kuwety.

4. MAGNETYCZNY REZONANS JĄDROWY

Magnetyczny rezonans jądrowy ma zastosowanie w badaniach struktury Z-DNA,

obszarów przejść B

→Z-DNA oraz dynamiki tych przejść. NMR stosowany jest także w

badaniach nad oddziaływaniem DNA z różnymi ligandami np. w badaniach nad
oddziaływaniem m.in. leków przeciwnowotworowych z DNA.

5. SPEKTROSKOPIA PROMIENIOWANIA RENTGENOWSKIEGO

Spektroskopia promieniowania rentgenowskiego stosowana jest w badaniach

krystalograficznych struktury DNA, w szczegółową charakterystykę w tym błędnie
tworzone pary zasad czy zasady pozahelikalne. Za pomocą tej metody można także badać
kompleksy DNA z różnymi związkami jak substancje przeciwnowotworowe i antybiotyki.

6. SPEKTROSOKOPIA RAMANA

Spektroskopia Ramana opisuje rotacyjne i oscylacyjne widma cząsteczek.

Pozwala ona na poznanie struktury pojedynczych grup atomów w układach
biologicznych, a także pozwala na uzyskanie informacji o szybkich zmianach
strukturalnych zachodzących w cząsteczkach biologicznych. W klasycznej metodzie
Ramana do wzbudzenia stosowany jest laser argonowy, gdzie DNA można badać w
roztworze, w formie odwodnionego włókna lub postaci krystalicznej.

7. SPEKTROSKOPIA W PODCZERWIENI

Spektroskopia w podczerwieni była jednym z klasycznych narzędzi w badaniach

nad strukturą i oddziaływaniem małych cząsteczek takich jak jony metali czy leki
łączące się z DNA poprzez interkalację.

8. SPEKTROSKOPIA FLUORESCENCYJNA

DNA nie wykazuje mierzalnej fluorescencji wewnętrznej z wyjątkiem niskich

temperatur. Z DNA wiążą się natomiast znaczniki intekalatorowe jak EtBr czy
barwniki akrydynowe, które fluorescencję wykazują. Jednak mają one tę wadę, że
wiążą się z DNA niespecyficznie wzdłuż całej długości helisy. W przeciwieństwie do
DNA fluorescencję wykazują białka, których fluorescencja w wielu przypadkach nie
zmienia się po związaniu z DNA.

9. DICHROIZM KOŁOWY (CD)

WYKONANIE ĆWICZENIA

Materiały i sprzęt

1.  Roztwór TE (10 mM Tris-base, 1mM EDTA, pH 8)
2.  1% roztwór agarozy
3.  Roztwór bromku etydyny (50 mg/ml)
4. Roztwór buforu elektroforetycznego TBE

×1 (90 mM Tris-base, 90 mM kwas

borowy,
2 mM EDTA, pH 8)

5. Roztwór obciążający LB (50% glicerol, 0,25% błękit bromofenylowy, 1 mM

EDTA)

6. Kolba Erlenmeyer'a 25 ml
7. Cylinder miarowy
8.

Aparat

elektroforezy

9. Pipety automatyczne: 1 ml, 0,1 ml, 0,02 ml
10.Probówki

eppendorf

11.Spektrofotometr UV-Vis
12.Kuwety kwarcowe

a. Charakterystyka wyizolowanego DNA – widmo absorpcji UV

• Rozcieńczyć 1:10 roztwór DNA przy pomocy buforu TE; w razie potrzeby

przygotować rozcieńczenie 1:100.

• Zmierzyć z użyciem kuwet kwarcowych absorpcje roztworu DNA przy długości

fali 230, 260 i 280 nm, stosując bufor TE jako odnośnik.

• Wyznaczyć stężenie DNA.

b. Elektroforeza w żelu agarozowym

• Naważkę 0,3 g agarozy rozpuścić w 30 ml buforu elektroforetycznego TBE×1 poprzez jej

zagotowanie w kuchence mikrofalowej, tak aby agaroza nie tworzyła widocznych agregatów.
Ostudzić tak przygotowany roztwór do około 50

°C i dodać 1 µl bromku etydyny

• Wlać roztwór agarozy do uprzednio przygotowanej formy (stolik elektroforetyczny) z

umocowanym grzebieniem formującym studzienki do nanoszeni próbek.

• Po zastygnięciu agarozy zalać żel buforem elektroforetycznym TBE×1. Powierzchnia buforu

powinna znajdować się około 1 mm ponad górną powierzchnią żelu. Powoli wyjąć grzebień, tak
aby nie uszkodzić studzienek żelu.

• Wymieszać w probówce eppendorfa 10 µl wcześniej przygotowanego roztworu DNA i 5 µl

roztworu obciążającego LB. Dokładnie rozpipetować. Całość umieść w jednej studzience żelu.

• Podłączyć elektrody aparatu elektroforetycznego do zasilacza. Elektroforezę prowadzić przez 30-

60 min przy napięciu 90 V.

• Obejrzeć żel umieszczony na transiluminatorze emitującej światło nadfioletowe λ = 302-312 nm.

Opracowanie wyników

1) Obliczyć stosunek absorpcji roztworu DNA przy 230, 260 i 280 nm (A

2 6 0

2 8 0 ,

2 6 0

2 3 0

). Skomentować różnicę pomiędzy otrzymaną wartością a wielkością

charakterystyczną dla wysoce oczyszczonego DNA.

2) Obliczyć stężenie DNA (mg/ml) w roztworze TE i na tej podstawie całkowitą

ilość otrzymanego DNA i wydajność oczyszczania dla ludzkich komórek
nowotworowych (A

2 6 0

= 1 to C

d s D N A

= 50

µg/ml; 1 mln komórek ≈ 6 µg DNA)

3) Porównać wydajność i czystość DNA izolowanego z komórek eukarotycznych i

prokariotycznych na podstawie uzyskanego elektroforogramu.