1
ĆWICZENIE IV
MIKROBIOLOGIA ŚRODOWISKA GLEBOWEGO
Wskaźniki aktywności biologicznej gleby - cd.
IV.1.Oddychanie gleby
wskaźnikiem dobrze oddającym obraz aktywności biologicznej gleby jest siła oddychania gleby,
czyli pobierania O
2
i/lub wydzielania CO
2
.
Oddychanie jest uniwersalnym procesem nie ograniczonym do mikroorganizmów, zaleŜy od
fizjologicznego stanu komórek i jest warunkowane przez róŜne czynniki glebowe tj. wilgotność (pomiary
przeprowadza się przy pojemności wodnej 50-70%), temperatura (stosowana jest temperatura inkubacji w
zakresie 20-30
o
C), dostępność składników odŜywczych i struktura gleby.
Aktywne Ŝywe komórki potrzebują stałego zaopatrzenia w energię, która w przypadku mikroorganizmów
heterotroficznych pochodzi z transformacji materii organicznej (celulozy, białek, nukleotydów i związków
zhumifikowanych). Reakcje odpowiedzialne za zaopatrywanie w energię w komórce są reakcjami redox
opartymi o transfer od donora do akceptora. W procesie oddychania, który jest utlenianiem materii
organicznej przez tlenowe mikroorganizmy tlen funkcjonuje, jako akceptor elektronów. Końcowym
produktem tego procesu jest CO
2
oraz H
2
O. Stąd metaboliczna aktywność mikroorganizmów glebowych
moŜe być wyznaczana poprzez pomiar wytwarzanego CO
2
czy pobieranego O
2
(Nannipieri et al. 1990).
Podstawowe oddychanie jest definiowane jako oddychanie bez dodatku substancji organicznej do gleby.
Oddychanie indukowane substratem (SIR) jest oddychaniem mierzonym po dodaniu substratu.
Współczynnik respiracji (oddychania):
2
.
.
2
.
ln
.
O
o
pobieraneg
V
CO
ionego
uwo
V
RQ
=
odzwierciedla stan fizjologiczny biomasy mikrobiologicznej w glebie i powinien mieć wartość 1.
Powietrze glebowe
Gleba posiada własną atmosferę podlegającą znacznie większym wahaniom niŜ atmosfera nad jej powierzchnią.
Powietrze wypełnia w glebie część porów i zajmuje ono makropory, a przy niskiej wilgotności gleby równieŜ część
mezoporów.
Skład chemiczny powietrza glebowego ulega zmianom w czasie sezonu wegetatywnego i w profilu glebowym.
Powietrze glebowe zawiera 10-100 x więcej CO
2
czyli 0,3 - 3,0%
Zawartość O
2
jest znacznie niŜsza niŜ 20%. W powietrzu glebowym jest więcej pary wodnej (często ok. 100%
nasycenia), a takŜe duŜo gazowych produktów rozkładu substancji organicznej tj. metan, etylen, N
2
O)
Intensywne procesy mikrobiologiczne, a zwłaszcza rozkład substancji organicznej sprzyja wzbogaceniu powietrza
glebowego w CO
2
.
Pojemność powietrzną zwaną teŜ porowatością powietrzną charakteryzuje maksymalna objętość porów zajętych
przez powietrze w stanie polowej pojemności wodnej.
Krytyczne wielkości pojemności powietrznej dla róŜnych gleb i roślin są trudne do ścisłego ustalenia.
Minimalna - krytyczna pojemność wynosi dla traw 5-10%, zbóŜ 15%, okopowych 20%.
Metody pomiaru oddychania glebowego
1. Pomiar oddychania glebowego
ex situ
Oddychanie glebowe moŜe być określane z uŜyciem prostych technik tj. inkubacja gleby w słojach
(Isermeyer 1952), zamkniętych płytkach Petriego (Pochon i Tardieux 1962) czy innych typach naczyń (Jäggi 1976).
CO
2
jest zwykle adsorbowany na NaOH i mierzony poprzez miareczkowanie za pomocą HCl.
Inne metody określania CO
2
są oparte o zmiany przewodności elektrycznej roztworu NaOH (Anderson i Domsch
1978a; Cheng i Coleman 1989), wymagają zastosowania chromatografii gazowej (Brookes i Paul 1987) czy
spektroskopii podczerwieni (Heinemeyer et al. 1989).
Znakowany CO
2
(
14
CO
2
) jest oznaczany przy monitorowaniu rozkładu specyficznych związków organicznych w
glebie (Naklas i Klein 1981). Pobieranie O
2
lub wydzielanie CO
2
moŜe być oznaczane za pomocą aparatu Warburga
2
(Domsch 1962; Stotzky 1965), poprzez pomiar elekrorespirometrem (Birch i Melville 1969; Kröckel and Stolp 1986;
Alef et al. 1988) czy chromatografii gazowej (Trevors 1985).
2. Pomiar oddychania glebowego in situ
Oddychanie glebowe moŜe być równieŜ określane bezpośrednio w glebie (Anderson 1982).
Metody te polegają na określeniu poziomu uwalnianego CO
2
z nienaruszonej gleby.
W metodzie długoterminowej (Anderson 1982) roztwór NaOH jest umieszczany w otwartym słoju pod
powierzchnią gleby a przestrzeń podlegająca pomiarowi jest okryta metalowym cylindrem zamkniętym od strony
górnej. Po okresie inkubacji roztwór NaOH jest usuwany i mierzona poprzez miareczkowanie.
W metodzie krótkoterminowej uwalniany ze znanej przestrzeni glebowej CO
2
jest zbierany przy uŜyciu
aparatury (Richter 1972) składającej się z 4 małych kolektorów gazu, rury do analizy gazu i małej pompy.
W rurze analitycznej CO
2
reaguje z hydrazyną (CO
2
+ N
2
H
2
NH
2
COOH), której zuŜycie poprzez zmiany
wskaźnika redox.
Pomiar stęŜenia CO
2
i O
2
moŜe być dokonywany na róŜnych głębokościach w oparciu analizę chromatografii
gazowej małych próbek wyciąganych z poŜądanej głębokości z uŜyciem próbnika do próbek gazowych i strzykawki
do pobierania gazu (Richter 1972; Anderson 1982).
Zastosowanie metod manometrycznych do pomiaru zmian ilości O
2
i CO
2
Metody manometryczne, obejmują metody:
2.1. wolumetryczne - pomiaru zmian objętości gazu np.:
-
w respirometrze Gilsona
-
w mikrorespirometrze
2.2. pomiaru zmian ciśnienia gazu np.:
-
w aparacie Warburga
2.1. Metody wolumetryczne
Respirometr Gilsona stosowanym głównie w USA.
Naczyńko identyczne jak w aparacie Warburga połączone
jest z manometrem napełnianym naftą. Metoda Gilsona jest
w zasadzie metodą wolumetryczną - słuŜy do pomiaru zmian
objętości gazu przy stałym ciśnieniu. Poziom płynu w
manometrze zmienia się wskutek pobierania lub wydzielania
gazu. Pomiar polega na doprowadzeniu poziomu płynu w
ramieniu manometru, połączonym z naczynkiem do
pierwotnej pozycji wykorzystując zmianę objętości gazu w
naczyńku. Dokonuje się tego za pomocą pokrętła
połączonego z naczyńkiem. Zmianę objętości odczytuje się
bezpośrednio na trójstopniowej skali połączonej z pokrętłem.
Mikrorespirometr stosowany jest do pomiaru wymiany gazowej u organizmów o małych rozmiarach. Podstawową
część tego przyrządu stanowi komora metalowa zamykana od góry wiekiem szklanym. Do komory dołączona jest
kapilara, w której znajduje się kropla zabarwionego płynu (nafty). Określoną ilość buforu węglanowego wprowadza
się na dno komory, natomiast badany obiekt umieszcza się w kropli wiszącej na ruchomym wieku. Druga taka sama
komora bez materiału roślinnego słuŜy jako termobarometr, który pokazuje ewentualne zmiany w objętości fazy
gazowej, spowodowane zmianami temperatury i ciśnienia. Odczytuje się przesunięcie się kropli nafty. Jest to metoda
wolumetryczna, w której dokonujemy pomiarów zmian objętości przy stałym ciśnieniu z dokładnością 10
-3
mm
3
.
2.2. Metoda pomiaru zmiany ciśnienia
2.2.1. Pomiar ciśnienia parcjalnego O
2
w agregatach glebowych
W glebach strukturalnych mikroorganizmy są zwykle usytuowane na powierzchni lub wewnątrz
pojedynczych agregatów, które tworzą masę glebową.
Dyfuzja O
2
do oddychających organizmów ma miejsce w porach międzyagregatowych i jest indukowana tylko
przez gradient stęŜenia O
2
, który jest wynikiem procesu oddychania. Stąd badanie aktywności mikroorganizmów
w ich środowisku oraz zaopatrzenie O
2
w glebach o dobrze wykształconej strukturze zaleŜy od właściwości
agregatów oraz od procesu pobierania O
2
i jego transportu.
3
Metoda polega na amperometrycznym pomiarze ciśnienia parcjalnego O
2
i in situ z zastosowaniem
mikroelektrody typu Clarka. JeŜeli napięcie polaryzacji platynowej katody jest stałe i waha się w zakresie –580
do –780 mV pomiar zaleŜy jedynie od stęŜenia O
2
.
Konstrukcja O
2
– czułej mikroelektrody Clarka została nakreślona przez Revsbecha i Warda (1983).
Stępniewski i in. (1991) skonstruował podobną mikroelektrodę i zasilany silnikiem układ mikronapędowy, który
pozwala na ciągły pomiar profilu pO
2
w agregatach gleby. Katoda platynowa i elektroda odniesienia (Ag/AgCl)
są umieszczone w elektrolicie wodnym (1M KCl) w zewnętrznej szklanej oprawie wykonanej ze szkła sodowo-
wapiennego o kształcie kapilary (
θ
5,0/7,0 mm) wyostrzonej na końcu poprzez wyciągnięcie w płomieniu w celu
uformowania końcówki. Końcówka zaopatrzona jest w błonę z gumy silikonowej, która jest ekstremalnie
przepuszczalna dla O
2
(RTV 108 General Electric). Katoda jest wykonana z drutu platynowego o średnicy 0,1
mm (0,05 m. długości). Przed pomiarem elektroda jest wypełniana metanolem a tlen usuwany jest w eksykatorze
pod ciśnieniem. Następnie metanol jest zastępowany 1M KCl, a końcówka elektrody jest całkowicie pokrywana
poliestrem.
2.2.2. Pomiar zmiany ciśnienia CO
2
(lub O
2
) w aparacie Warburga
Respirometr Warburga pozwala uchwycić zmiany ciśnienia przy stałej objętości układu.
Jest to metoda bardzo
czuła, zezwalająca na śledzenie bardzo małych zmian ilości gazu, rzędu
µ
moli.
Aparat Warburga moŜe umoŜliwić takŜe badanie i wyznaczanie aktywności właściwej (wyraŜana
w
µ
molach ilość substratu utlenianego w ciągu 1 min. Przez 1 mg białka preparatu enzymatycznego w optymalnych
warunkach temperatury, pH, stęŜenia substancji reagujących) konkretnego enzymu oddechowego.
Ś
ledząc za pomocą respirometru Warburga ubytek O
2
w mieszaninie zawierającej ekstrakt bezkomórkowy
Mycobacterium phlei (uzyskany przez oddziaływanie ultradźwiękami, przepuszczanie przez prasę Frencla lub
mechaniczne roztarcie w moździerzu) oraz bursztynian jako substrat bada się oksydazę bursztynianową.
Zapoznanie się z konstrukcją i zasadą działania aparatu Warburga
Konstrukcja urządzenia
Podstawową częścią aparatu Warburga jest respirometr składający się z naczyńka reakcyjnego wraz z bocznym
ramieniem i szklaną studzienką wmontowana w dno oraz właściwego manometru. Po podłączeniu naczyńka do manometru i
zamknięciu kranu trójdroŜnego, naczyńko wraz z manometrem stanowi hermetycznie zamkniętą całość. Wnętrze tego
respirometru składa się z fazy ciekłej wraz z zawieszonymi w niej drobnoustrojami i fazy gazowej (powietrza) ograniczonej z
jednej strony powierzchnią cieczy w naczyńku, z drugiej poziomem płynu manometrycznego tzw. Brodiego. Naczyńko umieszcza
się w łaźni wodnej, w której utrzymuje się stała i optymalną temperaturę, a ponadto podlega ono rytmicznym wahaniom w celu
lepszej dyfuzji gazów (O
2
do cieczy i CO
2
z cieczy). Ciśnienie atmosferyczne i temperatura łaźni wodnej w czasie oznaczania nie
są w praktyce stałe i dlatego stosuje się manometry kontrolne zwane termomanometrami, zawierającymi w naczyńku tylko wodę.
Aparat Warburga jest manometrem typu stałej objętości, gdyŜ pomiar dokonywany jest po doprowadzeniu gazu w
aparacie do stałej objętości. W wyniku reakcji następuje pobieranie lub wydzielanie gazu przez badana próbę (w naczyńku
aparatu) i związane z tym zmiany ciśnienia. W metodzie bezpośredniej Warburga określamy pobór tlenu po całkowitym usunięciu
wydzielonego CO
2
. Zapewnia to wprowadzenie do studzienki naczyńka 0,2 ml 30% KOH. Pomiarowi podlega nie zmiana
objętości gazu, lecz zmiana ciśnienia (przy stałej objętości) wyraŜana w mm płynu Brodiego (23g NaCl, 5g cholanu sodu, 100mg
błękitu Evansa (kwas 1-amino-x naftalenodwusulfonowy) w 500 ml H
2
O) wypełniającego manometr. CięŜar właściwy płynu
Brodiego wynosi 1,033 g/ml, a ciśnienie atmosferyczne 760 mmHg = 10000 mm słupa płynu Brodiego.
Zasada pomiaru
Po doprowadzeniu płynu Brodiego w zamkniętym ramieniu manometru (połączonym z naczyńkiem) do punktu ”0” (150 mm)
odczytuje się poziom płynu w otwartym ramieniu. W przypadku wydzielania gazu poziom ten podnosi się (+h), przy pobieraniu
gazu poziom opada (-h). znając zmianę ciśnienia h i stała naczyńkową dla danego układu (manometr + naczyńko) moŜna obliczyć
objętość pobranego lub wydzielonego w czasie reakcji gazu. W celu przeliczenia zmiany ciśnienia na odpowiadającą jej objętość
gazu konieczne jest uwzględnienie szeregu czynników takich jak: objętość fazy gazowej układu róŜna dla róŜnych naczynek),
rozpuszczalność gazu w cieczy, sprowadzenie do warunków normalnych (0
o
C, 760 mmHg).
Te czynniki uwzględnia stała naczyńkowa k.
273
Vg x T +
Vc
x
a
k = --------------------------------------------------------------
P
o
Vg
-
objętość fazy gazowej układu- róŜnica między całkowitą objętością układu wyznaczoną przez kalibrowanie, a
objętością cieczy w naczyńku,
V
c
-
objętość cieczy w naczyńku – łączna objętość roztworów jakie będą stosowane w badaniach,
T
-
temperatura łaźni wodnej w skali bezwzględnej,
a
-
rozpuszczalność badanego gazu w cieczy w tej samej temperaturze (dane z tabeli)
4
P.
o
-
10 000 mm słupa Brodiego
Przykład oznaczania stałej k
JeŜeli wyznaczona przez kalibrowanie objętość układu wynosi 12,0ml i pomiary pobierania O
2
mają być wykonane w
temperaturze 25
o
C przy łącznej objętości 3 ml cieczy w naczyńku, wówczas:
Vg = (12-3) = 9ml = 9000
µ
l
Vc = 3ml = 3000
µ
l
a O
2
w 25
o
C = 0,0283 (dane z tabeli)
T = 273 + 25 = 298
P.
o
= 10 000 mm płynu Brodiego
A zatem wartość stałej naczynkowej dla pomiarów pobierania tlenu dla tego naczyńka wynosi:
273
9000
x
298 + 3000
x 0,0283
8245 + 84
k = ---------------------------------------------------------------- = ------------ ---- = 0,833
10 000
10 000
w celu obliczenia rzeczywistej zmiany ciśnienia podczas reakcji, naleŜy uwzględnić zmiany wywołane zmianami ciśnienia
atmosferycznego a takŜe zmiany temperatury w łaźni wodnej. W tym celu musimy uwzględnić zmiany zaobserwowane na
termobarometrze.
Przykład obliczania zmiany rzeczywistej ciśnienia:
Na początku oznaczania poziom płynu w otwartym ramieniu manometru próby właściwej wynosi 150 mm i w termobarometrze
równieŜ 150 mm. Po pewnym czasie np. 10 min. poziom płynu w manometrze próby właściwej opada do 120 mm tj. o 30 mm, a
w termobarometrze do 148 mm tj. o 2 mm. Rzeczywista zmiana ciśnienia wynosi zatem tylko 28 mm.
W przypadku zgodnego kierunku zmian poziomu w termobarometrze (h
t
) i w próbie właściwej naleŜy bezwzględną wartość
odczytu próby właściwej zmniejszyć o poprawkę h
t
. Gdy kierunek zmiany poziomu w termobarometrze jest przeciwny naleŜy
zwiększyć o poprawkę h
t
.
Objętość (x) pobranego lub wydzielonego gazu wyraŜa się w
µ
l
Równa się ona iloczynowi zmiany rzeczywistej ciśnienia h i stałej naczynkowej
X = h x k/
µ
l gazu
Technika pomiaru
Wykonanie oznaczenia na aparacie Warburga obejmuje następujące czynności:
1.
Do komory głównej czystych i suchych naczynek odmierza się lub przenosi określoną ilość badanej próby
2.
Wazeliną smaruje się szlif manometru i koreczka w bocznym ramieniu naczyńka
2.
Do studzienki odmierza się 0,2ml 30% roztworu KOH
3.
W studzience umieszcza się pofałdowany skrawek bibuły (2 x 2 cm)
4.
Naczyńka przymocowuje się do manometrów
5.
Cały zestaw manometrów umieszcza się w łaźni wodnej o odpowiedniej temperaturze
6.
Dla wyrównania temperatury układu wytrząsa się cały zestaw manometrów z otwartymi kranami
trójdzielnymi przez okres 10 –15 min.
7.
Ciecz w manometrze doprowadza się do punktu “zerowego” (150 mm)
8.
Zamyka się krany trójdzielne
9.
W określonych odstępach czasu odczytuje się i notuje poziom cieczy w manometrach po doprowadzeniu
poziomu płynu Brodiego w zamkniętym ramieniu do 150 mm
10.
Po wyjęciu naczynek z łaźni (po skończonym doświadczeniu) naleŜy pamiętać o otwarciu kranu
trójdzielnego, aby uniknąć wciągnięcia płynu manometrycznego do naczyńka.
5
IV.2.Testy mikroskopowe
IV.2.1.Wyznaczanie liczby komórek w komorze Thoma
Komora Thoma
Siatka licznika z 5 duŜymi kwadratami
(bez naroŜnych części)
Głębokość komory: 0,1 mm
Najmniejszy kwadrat: 0,0025 mm
2
DuŜy centralny kwadrat jest podzielony na 16
grupowych kwadratów,
które z kolei podzielone są na 16 mini kwadratów.
Objętość najmniejszego kwadratu:
0,1 mm x 0,0025 mm
2
= 0,00025 mm
3
= 0,00000025
cm
3
Objętość „16” – 16 najmniejszych kwadratów:
16 x 0,00025 mm
3
= 0,004 mm
3
= 0,000004 cm
3
Komora Thoma:
widok ogólny
siatka i powiększenie siatki
Wzór na liczbę komórek w 1 cm
3
(X) –
dla komórek stosunkowo duŜych
przynajmniej 5 µm (np. erytrocyty, leukocyty, zarodniki grzybów), które zlicza się w „16”
000004
,
0
a
x
=
lub
250000
•
=
a
x
x - liczba komórek w 1 cm
3
(1 ml); a - liczba komórek w „16” (0,000004 cm
3
)
dla bardzo małych komórkach liczonych w najmniejszym kwadracie
00000025
,
0
a
x
=
lub
4000000
•
=
a
x
x - liczba komórek w 1 cm
3
(1 ml); a - średnia liczba komórek w małym kwadracie
lub
4000000
•
=
an
x
n - rozcieńczenie badanej próby
(często w literaturze teŜ taki zapis x = 4 x 10
6
a n)
Zadanie do wykonania
Wykonaj zawiesiny zarodników grzyba z rodzaju:
1.
Fusarium spp.
2.
Penicillium spp.
NałóŜ szkiełko na komorę.
Nanieś zawiesinę pod szkiełko
Gęstość zawiesiny makrokonidii Fusarium spp. wyznacz na podstawie zliczenia w „16”
Gęstość zawiesiny mikrokonidii Penicillium spp. wyznacz na podstawie zliczenia
w najmniejszym kwadracie
Podstaw wartości zliczenia do odpowiednich wzorów
Oblicz i zapisz gęstość zarodników badanych grzybów w 1 ml zawiesiny
6
IV.2.2.
Badanie stopnia kolonizacji korzeni przez grzyby endomikoryzowe (VAM)
zmodyfikowaną metodą Philipsa i Haymana (Philips i Hayman, 1970) w modyfikacji Mortona (Morton, 1990).
Zjawisko mikoryzy moŜna zaobserwować na przygotowanych z fragmentów korzeni i odpowiednio utrwalonych
preparatach. Preparaty utrwala się w poliwynylo – laktoglicerolu (PVLG) lub w jodzie (odczynnik Melzera).
Przy stosowanej preparatyce tkanki korzeniowej uzyskuje się szkielet tkanki korzeniowej (ściany komórkowe i
wiązki naczyniowe) z wybarwionymi na ciemno niebieski lub granatowy kolor strzępkami, arbuskulami i/lub
wezikulami grzybów VAM.
Strzępki grzybów VAM, wezikule, arbuskule są zawsze kontrastowe do „tła” wytrawionej tkanki korzeniowej,
znacznie grubsze (ok. 5
µ
m.) od strzępek innych grzybów i nieseptowane. Wewnątrz korzeni strzępki VAM biegną
najczęściej równolegle do wiązek naczyniowych, poza korzeniami są mocniej wybarwione (do ciemnego granatu) i
optycznie grubsze, z wypustkami i rozgałęzieniami. Dla zaobserwowania róŜnic pomiędzy grzybem mikoryzowym,
a grzybem nie – mikoryzowym celowe jest porównanie obrazu korzeni tej samej rośliny (np. pszenicy) ze strzępkami
grzyba VAM oraz ze strzępkami innego grzyba (np. patogenicznego - Gaeumannomyces graminis v. tritici - Ggt).
Procedura barwienia korzeni roślin
Próbki korzeni roślin przechowywane w zamraŜarce rozmroŜa się w temp. pokojowej (ok. 20
o
C). Korzenie oddziela
się od gleby przez łagodne przemywanie wodą bieŜącą na sicie o średnicy oczek 400
µ
m. Korzenie naleŜy pociąć na
2 – 5 mm fragmenty i pozostawić w wodzie przez ok. 5min. dla ich uwodnienia. Próbki tak przygotowanych korzeni
umieszcza się w tygielkach Goocha z perferowanym dnem, zanurza w 10% roztworze KOH i autoklawuje przez
3 min. przy 1atm/121
o
C celem odbarwienia tkanki korzeniowej (naleŜy zastosować powolną dekompresję komory
autoklawu dla uniknięcia uszkodzeń struktury tkanki korzeniowej).
Próbki przemywa się dokładnie H
2
O dest. i zanurza na 1 godz. w 10% roztworze HCl i ponownie przemyć H
2
O
dest.. Następnie próbki zanurza się w roztworze barwnika (błękit trypanowy w laktoglicerolu) i ponownie
autoklawuje. Próbki korzeni naleŜy ostudzić i odsączyć z nadmiaru barwnika.
Następnie przenosi się próbki korzeni na podstawowe szkiełka mikroskopowe z naniesioną wcześniej kroplą
poliwinylo-laktoglicerolu (PVLG).
Po zamknięciu szkiełkiem nakrywkowym i łagodnym przesuszeniu (30
o
C) uzyskuje się trwały preparat – wzorzec
danej próbki przechowywany w temperaturze pokojowej.
Oznaczanie stopnia kolonizacji mikoryzowej korzeni
Kolonizację endomikoryzową korzeni oznacza się metodą mikroskopową. W 50 wybranych polach obserwacji
mikroskopowej preparatu naleŜy przeprowadzić obserwację występowania struktur VAM przy powiększeniu 100 x.
Za fragment skolonizowany przyjmuje się obecność w polu widzenia kaŜdej formy morfologicznej grzyba
endomikoryzowego: arbuskul, wezikul lub strzępek grzyba VAM w tkance korzeniowej.
Wartość procentową kolonizacji oblicza się według wzoru:
liczba fragmentów skolonizowanych/50 fragmentów korzeni x 100
Wykonanie ćwiczenia:
Preparaty:
grzyb VAM – korzenie pszenicy (rosnącej na madzie)
grzyb patogeniczny Gaeumannomyces graminis v. tritici– korzenie pszenicy (rosnącej na madzie)
grzyb VAM – korzenie Ŝyta (rosnącej na rędzinie)
grzyb VAM – korzenie koniczyny (rosnącej na czarnej ziemi)
grzyb Glomus etunicatum utrwalony w PVLG
grzyb Glomus etunicatum utrwalony w PVLG
Przeszukiwać preparaty przy powiększeniu obiektywu 10 x i dopiero po znalezieniu interesującego fragmentu
zwiększyć powiększenie obiektywu (do 20 – 40 x – bez imersji)
•
Wykonać szkic obrazu mikroskopowego i opisać zaobserwowane struktury tworzone przez grzyba VAM
•
Porównać wygląd grzyba VAM i grzyba patogenicznego
(Strzępki Ggt poddane barwieniu błękitem trypanowym są nieregularne, septowane, jasnozłotego koloru i
znacznie cieńsze od strzępek VAM.)
•
Porównać obraz zaobserwowany na: korzeniach róŜnych roślin; korzeniach rosnących w róŜnych glebach
•
Określić stopień kolonizacji mikoryzowej korzenia przeprowadzając obserwację w 50 polach widzenia
preparatu, licząc fragmenty skolonizowane i wyliczając procentową wartość kolonizacji wg. podanego powyŜej
wzoru.
7
Zagadnienia do zaliczenia nr 1
1.
Podręcznik „Mikrobiologia i biochemia gleb” Paul i Clark
rozdział 3 –
Metody badań mikroorganizmów glebowych Zasada pobierania próbek glebowych;
o
Mikroskopowe metody badania próbek;
o
Sposób oznaczania bioobjętości i biomasy;
o
Cząstki sygnalne i ich oznaczanie;
o
Metody analizy kwasów nukleinowych w glebie;
o
Metody fizjologiczne: hodowle laboratoryjne mikroorganizmów glebowych i techniki
respiracyjne;
o
Formy występowania enzymów w glebie;
o
Czynniki zapewniające stabilność aktywności enzymatycznej gleby;
2.
część teoretyczna i doświadczalna (skrypty) do ćwiczeń