Ćwiczenie 9 (MOiŚ)
T: Metody oznaczania ogólnej liczby drobnoustrojów
1) Oznaczanie ogólnej liczby drobnoustrojów w 1 ml próby badanej (NPL)
a) metoda probówkowa
b) metoda płytek agarowych
2) Oznaczanie liczby bakterii w 100 ml próby badanej
3) Metoda filtrów membranowych
1) Oznaczanie ogólnej liczby drobnoustrojów w 1 ml (NPL)
a) metoda probówkowa
wykonujemy 6 rozcieńczeń badanej próby w postępie dziesiętnym; rozcieńczenia
wykonujemy w 0,85% NaCl
każdemu rozcieńczeniu próby przyporządkowujemy 5 probówek wypełnionych 10 ml
bulionu zwykłego. Do każdej z tych 5 probówek wlewamy po 1 ml próby z odpowiedniego
rozcieńczenia.
inkubujemy 24 h
zliczamy probówki z poszczególnych rozcieńczeń w których obserwujemy wzrost bakterii
(wynik dla każdego z rozcieńczeń będzie od zera do pięciu)
zapisujemy wyniki i układamy tzw. liczbę charakterystyczną; liczba charakterystyczna
składa się z 3 cyfr;
Pierwsza cyfra przyporządkowana jest ostatniemu rozcieńczeniu, które daje wzrost we
wszystkich próbach (lub w maksymalnej ilości), a kolejne cyfry liczby charakterystycznej
oznaczają liczbę prób dodatnich z kolejnych rozcieńczeń
Przykład
10
-1
10
-2
10
-3
10
-4
10
-5
10
-6
5
5
5
2
0
0
Odczytana liczba charakterystyczna to 520
Porównujemy wynik z tablicami Makrediego:
Dla 520 wynik z tablic to 5
Mnożymy liczbę odczytaną z tablic razy odwrotność rozcieńczenia odpowiadającego
pierwszej cyfrze liczby charakterystycznej (
5
20) czyli 10
-3
NPL= 5 x odwrotność rozcieńczenia
NPL= 5x10
3
= 5 x 1000
NPL = 5000 komórek bakteryjnych
Otrzymana liczba to liczba bakterii w 1 ml badanej próby. Oczywiście nie jest to pomiar co
do jednej komórki bakteryjnej tylko przybliżony odczyt lub nawet rząd wielkości.
[[[[[[]]]]]]]]
!!! Wyjątki w tworzeniu liczby charakterystycznej:
jeżeli wszędzie są piątki to bierzemy 3 ostatnie cyfry, odczytujemy z tablic McCrady’ego ale stawiamy znak
większości, a nie równości
10
-1
10
-2
10
-3
10
-4
10
-5
10
-6
5
5
5
5
5
5
--> 555
NPL > odczyt z tablic x 10
-4
jeżeli żadne z rozcieńczeń nie dają 5 wyników pozytywnych to pod uwagę bierzemy rozcieńczenie z najwyższą
liczbą prób dodatnich i dwa kolejne rozcieńczenia
2
0
0
0
0
0
--> 200
NPL > odczyt z tablic x 10
-1
jeżeli ostatnia cyfra liczby charakterystycznej to 1, a za nią w kolejnym rozcieńczeniu jest również 1 to
sumujemy obie jedynki i wpiusujemy 2 w miejsce ostatniej cyfry liczby charakterystycznej
5
5
3
1
1
0
liczba charakterystyczna to 532
[[[[[[[[]]]]]]]]
b) metoda płytek agarowych (metoda płytek lanych)
wykonujemy rozcieńczenia dziesiętne badanej próby
każdemu rozcieńczeniu przyporządkowujemy 2 płytki Petriego
na każdą płytkę wylewamy po 1 ml każdego rozcieńczenia i zalewamy 10 ml upłynnionego
agaru o temperaturze max. 42°C
inkubujemy 24 h
zliczamy liczbę kolonii (kolonie na powierzchni i kolonie wgłębne) w każdej parze płytek
agarowych
do obliczenia wyniku bierzemy pod uwagę płytki zawierające 10-300 kolonii; z każdej pary
płytek spełniających wymaganie wyciągamy średnią liczbę kolonii
Przykład:
10
-1
10
-2
10
-3
10
-4
10
-5
10
-6
>300 >300 70
9
0
1
>300 270
50
13
2
1
wynik to 60
mnożymy wynik przez odwrotność rozcieńczenia i otrzymujemy NPL jednostek
tworzących kolonie (CFU) w 1 ml
jeżeli będą 2 rozcieńczenia spełniające wymagania to oba bierzemy pod uwagę wyciągając
średnią
2) Oznaczanie liczby bakterii w 100 ml próby badanej
a) metoda posiewów trójkowych
wlewamy po10 ml badanej próby do trzech kolbek zawierających po 100 ml podłoża
wlewamy po 1 ml badanej próby do trzech probówek zawierających po 10 ml podłoża
wlewamy po 0,1 ml badanej próby do trzech probówek zawierających po 10 ml podłoża
Łącznie 9 kolbek/probówek
inkubujemy 24h w optymalnej temperaturze
Zliczamy liczbę prób dodatnich w każdym rozcieńczeniu, np:
3 x 10:100
3 x 1:10
3 x 0,1:10
1/3
0/3
1/3
Tworzymy trzycyfrową liczbę: „101”
Odczytujemy z odpowiednich tablic wartość odpowiadającą ustalonym próbom. Wartość
odczytana z tablic to NPL bakterii w 100 ml wody (wskaźnik wody).
[[[[[[]]]]]]
Inny system posiewu trójkowego:
3 x 100ml próby do 100 ml pożywki
3 x 10ml próby do 100 ml pożywki
3 x 1 ml próby do 10 ml pożywki
W tym wypadku wynik odczytany z tablicy dzielimy przez 10 ponieważ podaliśmy 10x
więcej próby.
[[[[[[]]]]]]
3) Metoda filtrów membranowych
przefiltrować daną objętość próby przez krążek o odpowiedniej średnicy porów
Można przefiltrować 1ml, 10ml, 50ml, 100ml i inne objętości próby ale zawsze musimy
przefiltrować co najmniej 25 ml płynu przez sączek. Jeżeli chcemy przefiltrować tylko 1ml
próby (bo jest ona bardzo zagęszczona itd.) To dodajemy do tej próby 24 ml 0,85% NaCl i
dopiero wtedy filtrujemy.
krążek umieścić na pożywce
inkubacja 24h w optymalnej temperaturze
zliczamy kolonie, które rosną na filtrze; bierzemy pod uwagę tylko liczbę kolonii
mieszczącą się w szeregu optymalnym tzn. 6-96 kolonii.
Wskaźnik = liczba kolonii x 100 / ilość przefiltrowanej wody w ml
Wskaźnik: liczba kolonii w 100 ml próby
Miano = 100/wskaźnik
(MIANO: najmniejsza objętość próby, w której znajduje sie 1 komórka bakteryjna)