Ćwiczenie

T: Metody oznaczania ogólnej liczby drobnoustrojów

1) Oznaczanie ogólnej liczby drobnoustrojów w 1 ml (NPL)

a) metoda probówkowa

b) metoda płytek agarowych

2) Oznaczanie liczby bakterii w 100 ml próby badanej

3) Metoda filtrów membranowych

1) Oznaczanie ogólnej liczby drobnoustrojów w 1 ml (NPL)

a) metoda probówkowa



wykonujemy 6 rozcieoczeo badanej próby w postępie dziesiętnym; rozcieoczenia

wykonujemy w 0,85% NaCl [1ml do 9ml, 1 ml do 9ml, 1ml do 9ml itd.)



każdemu rozcieoczeniu próby przyporządkowujemy 5 probówek wypełnionych 10 ml

bulionu zwykłego. Do każdej z tych 5 probówek wlewamy po 1 ml próby z odpowiedniego
rozcieoczenia.



inkubujemy 24 h



zliczamy probówki z poszczególnych rozcieoczeo w których obserwujemy wzrost bakterii

(wynik dla każdego z rozcieoczeo będzie od zera do pięciu)



zapisujemy wyniki i układamy tzw. liczbę charakterystyczną; liczba charakterystyczna

składa się z 3 cyfr;

pierwsza cyfra przyporządkowana jest ostatniemu rozcieoczeniu, które daje wzrost we
wszystkich próbach (lub w maksymalnej ilości prób jeżeli w żadnej nie ma 5), a kolejne
cyfry liczby charakterystycznej oznaczają liczbę prób dodatnich z kolejnych rozcieoczeo

Przykład

10

-1

10

-2

10

-3

10

-4

10

-5

10

-6

5

5

5

2

0

0

Odczytana liczba charakterystyczna to 520

Porównujemy wynik z tablicami Makrediego:

Wynik dla 520 odczytany z tablic to 5

Określamy Najbardziej Prawdopodobną Liczbę Bakterii w 1 ml:

NPL=5 x odwrotnośd rozcieoczenia pierwszej cyfry liczby charakterystycznej

NPL=5x10

3

=5000

Wyjątki:



jeżeli we wszystkich próbach obserwujemy wzrost to bierzemy 3 ostatnie cyfry,

odczytujemy z tablic McCrady’ego ale przy określaniu NPL stawiamy znak większości, a nie
równości

5

5

5

5

5

5



jeżeli 2

0

0

0

0

0

to 200 x 10

1



jeżeli 5

5

3

1

1

0

to dodajemy ostatnie 2 cyfry czyli

nasza liczba charakterystyczna to 532

b) metoda płytek agarowych (metoda płytek lanych)



wykonujemy rozcieoczenia dziesiętne badanej próby



każdemu rozcieoczeniu przyporządkowujemy 2 płytki Petriego



na każdą płytkę wylewamy po 1 ml każdego rozcieoczenia i zalewamy 10 ml upłynnionego

agaru o temperaturze max. 42°C



inkubujemy 24 h



zliczamy liczbę kolonii (kolonie na powierzchni i kolonie wgłębne) w każdej parze płytek

agarowych



do obliczenia wyniku bierzemy pod uwagę płytki zawierające 10-300 kolonii; z każdej pary

płytek spełniających wymaganie wyciągamy średnią

Przykład:

10

-1

10

-2

10

-3

10

-4

10

-5

10

-6

>300 >300 70

9

0

1

>300 270

50

13

2

1

wynik to średnia z 70 i 50 czyli 60



mnożymy wynik przez odwrotnośd rozcieoczenia i otrzymujemy NPL jednostek

tworzących kolonie (CFU) w 1 ml



jeżeli będą 2 rozcieoczenia spełniające wymagania to oba bierzemy pod uwagę wyciągając

średnią

2) Oznaczanie liczby bakterii w 100 ml próby badanej

a) metoda posiewów trójkowych



wlewamy 3 x 10 ml badanej próby do trzech kolbek zawierających po 100 ml podłoża



wlewamy 3 x 1 ml badanej próby do trzech probówek zawierających po 10 ml podłoża



wlewamy 3 x 0,1 ml badanej próby do trzech probówek zawierających po 10 ml podłoża

Łącznie daje to 9 kolbek/probówek



inkubujemy 24h w optymalnej temperaturze



Zliczamy liczbę prób dodatnich w każdym rozcieoczeniu, np.:

3 x 10:100

3 x 10:10

3 x 0,1:10

1

0

1

Odczytujemy z tablic wartośd odpowiadającą ustalonym próbom (101). Wartośd
odczytana z tablic to NPL bakterii w 100 ml wody (wskaźnik wody).

Inny system posiewu:

3 x 100:100

3 x 10:10

3 x 1:10

W tym wypadku wynik odczytany z tablicy dzielimy przez 10 ponieważ podaliśmy 10x
więcej próby.

3) Metoda filtrów membranowych



przefiltrowad X ml próby przez krążek o odpowiedniej średnicy porów (może byd 1, 10, 50,

100 ml i inne objętości próby ale zawsze musimy przefiltrowad co najmniej 25 ml płynu;
jeżeli filtrujemy np. 1ml próby to dodajemy 24 ml 0,85% NaCl, żeby otrzymad 25 ml płynu)



krążek zdjąd z urządzenia filtrującego i umieścid na pożywce



inkubacja 24h w optymalnej temperaturze



zliczamy kolonie, które rosną na filtrze; bierzemy pod uwagę tylko liczbę kolonii

mieszczącą się w szeregu optymalnym tzn. 6-96 kolonii. Jeżeli liczba kolonii wykracza poza
szereg optymalny badanie należy powtórzyd wybierając inną objętośd filtrowanej próby.



obliczamy wskaźnik

Wskaźnik: liczba kolonii x 100 / ilośd przefiltrowanej wody w ml



obliczamy Miano

MIANO: najmniejsza objętośd próby, w której znajduje sie 1 komórka bakteryjna

MIANO=100/wskaźnik