GENETYKA MOLEKULARNA BAKTERII I WIRUSÓW
M. Wędzony
Notatki na podstawie róŜnych źródeł internetowych (m.in. Wikipedia), zmodyfikowane
Organizacja materiału genetycznego bakterii
Pojedynczy chromosom prokariotyczny zawiera praktycznie całą informację genetyczną.
Zdecydowana większość bakterii ma chromosom kolisty i nie posiada błony oddzielającej go
od cytoplazmy, co daje moŜliwość bliskiego występowania procesu produkcji
mRNA
na
matrycy DNA oraz maszynerii odpowiedzialnej za biosyntezę białek.
W komórkach prokariotycznych procesy transkrypcji i translacji zachodzą jednocześnie do
tego stopnia, Ŝe moŜliwe jest rozpoczęcie translacji na jednym końcu
mRNA
zanim zostanie
zakończona transkrypcja na drugim końcu.
Kolisty chromosom bakteryjny jest podzielony na kilkadziesiąt pętli, które mają końce
unieruchomione w białkowym szkielecie. Białka występujące w chromosomach bakteryjnych
tzw. białka histonopodobne, poza organizowaniem DNA w chromosomie pełnią jeszcze
pewne dodatkowe funkcje przypominając działaniem czynniki transkrypcyjne w komórkach
eukariotycznych.
Mapa chromosomu bakteryjnego daje pewne wiadomości o jego organizacji. Poza niektórymi
grupami genów skupionymi w operony, nie da się zaobserwować konkretnego wzorca,
według którego następowałaby lokalizacja genów w chromosomie bakteryjnym. Transkrypcja
operonów moŜe zachodzić dla niektórych w jednym kierunku, a dla innych w przeciwnym.
Miejsce replikacji chromosomu bakteryjnego jest ściśle określone tzw.ori (origin of
replication) dla kaŜdego typu bakterii, ponadto podobna dla wszystkich bakterii jest aranŜacja
genów zarówno w ori jak i w miejscu terminacji syntezy DNA. U niektórych bakterii wydaje
się waŜne, aby w przypadku pewnych regionów genomu kierunek transkrypcji był taki sam
jak kierunek poruszania się widełek replikacyjnych DNA.
Replikacja DNA bakteryjnego
W replikacji DNA głównym problemem jest precyzyjna duplikacja sekwencji
nukleotydowych, co zachodzi dzięki parowaniu komplementarnemu. Proces replikacji jest
semikonserwatywny, co oznacza, Ŝe wyprodukowane podwójne helisy zawierają jedną nić
rodzicielską i jedną nowoutworzoną.
Replikacja zachodzi od 5' do 3' końca dzięki polimerazom DNA. Enzymy te nie mogą
rozpocząć syntezy nowej nici bez primera (zwykle krótka cząsteczka RNA).
Dobrze poznany jest mechanizm replikacji u E. coli. Proces ten zaczyna się w ori (origin of
replication, około 300 bp rozpoznawanych przez specyficzne białka). W ori podwójna helisa
DNA otwiera się i zachodzi inicjacja na obu niciach jednocześnie z utworzeniem specyficznej
struktury tzw. widełek replikacyjnych.
W kolistym DNA E. coli dwukierunkowa replikacja prowadzi do powstania struktur theta. U
bakterii tej są trzy polimerazy DNA: I, II i III. Polimeraza DNA III działa w widełkach
replikacyjnych dodając nowe nukleotydy. W celu zajścia replikacji podwójna helisa DNA jest
rozwijana przez helikazę i stabilizowana przez białko SSBP (single stranded binding protein).
Pomiędzy syntezą DNA na obu niciach istnieją wyraźne róŜnice. Synteza na nici wiodącej 5'
3' przebiega w sposób ciągły, gdyŜ jest koniec 3'OH, do którego moŜna dodać nowy
nukleotyd. Na drugiej nici DNA jest syntetyzowane fragmentami, poniewaŜ nie ma końca
3'OH i konieczne jest zsyntetyzowanie małego primera RNA, aby dostarczyć wolne grupy
3'OH. Po syntezie primera, primeaza jest zastępowana przez polimerazę DNA III, która
dodaje nukleotydy do momentu dojścia do uprzednio zsyntetyzowanego DNA. Wtedy
polimeraza DNA III jest odłączana a pojawia się polimeraza DNA I, która poza zdolnością do
syntezy DNA, moŜe usuwać primer RNA znajdujący się przed nią. Po usunięciu primera
polimeraza DNA I jest uwalniania i ostatnie wiązanie fosfodiestrowe zostaje wyprodukowane
przy pomocy ligazy DNA.
Podczas syntezy DNA w widełkach replikacyjnych następują zmiany w zwinięciu DNA
spowodowane przez enzymy rozplatające oraz topoizomerazy, które w pewnym stopniu
regulują proces replikacji.
Błędy replikacyjne naprawiane są przez polimerazę DNA III, która poza zdolnością do
syntezy DNA, ma aktywność 3'
5' egzonukleazy, co oznacza, Ŝe usuwa ona źle wstawiony
nukleotyd i zastępuje go nukleotydem prawidłowym. System naprawczy nie zawsze zdoła
wychwycić wszystkie błędy, co moŜe spowodować powstanie mutacji.
Regulacja ekspresji genów u bakterii
Transkrypcja u bakterii
Pierwszym etapem ekspresji kaŜdego genu jest transkrypcja. Prowadzi ona do powstania
RNA na matrycy DNA. Proces ten jest przeprowadzany przez polimerazę RNA, a
prekursorami są ATP, GTP, UTP, CTP. W przeciwieństwie do polimerazy DNA polimeraza
RNA moŜe zacząć nową nić bez primera. Wszystkie polimerazy RNA u bakterii są
skomplikowanymi enzymami składającymi się z wielu podjednostek. Enzym ten u E. coli
zawiera podjednostki
β
,
β
',
α
w dwóch kopiach oraz
σ
, która jest luźno związana z
pozostałymi i łatwo moŜe oddysocjować. Wiązanie polimerazy RNA do DNA odbywa się w
specjalnych miejscach promotorowych. Cząsteczka
σ
bierze udział tylko w formowaniu
początkowego kompleksu polimerazy RNA z DNA i jest odpowiedzialna za rozpoznanie
promotorów: sekwencji -35 od miejsca inicjacji i sekwencji Pribnow box w regionie -10 od
miejsca inicjacji. W wyniku działania polimerazy RNA w kierunku 5'
3' powstaje
mRNA
.
U Prokaryota pojedyncza molekuła
mRNA
często koduje więcej niŜ jedno białko ze względu
na występowanie grup genów zwanych operonami. Polimeraza RNA transkrybuje wtedy
wszystkie geny z danego operonu na pojedynczą molekułę
mRNA
(tak zwane
policystroniczne
mRNA
). W
mRNA
u Prokaryota zazwyczaj nie występują introny, jednak
jeśli juŜ się tam znajdą to są samoistnie wycinane przez RNA (zwane rybozymem).
mRNA
podlega na ogół bezpośredniej translacji natomiast
tRNA
i
rRNA
powstają jako długie
cząsteczki prekursorowe, które są następnie cięte w kilku miejscach w celu utworzenia
dojrzałych cząsteczek RNA.
Translacja u bakterii
Translacja zachodzi w kilku etapach: inicjacja, elongacja, terminacja, uwolnienie i
sfałdowanie polipeptydu przy wykorzystaniu całej maszynerii jaką jest m.in. rybosom. U
Prokaryota rybosomy składają się z dwóch podjednostek: 30S i 50S dających w połączeniu
rybosom 70S. Podjednostka 30S zawiera 16S
rRNA
i około 21 białek, natomiast
podjednostka 50S zawiera 5S i 23S
rRNA
i około 34 białek.
Inicjacja syntezy białek zaczyna się od uformowania kompleksu zawierającego podjednostkę
30S,
mRNA
,
tRNA
dla formylometioniny i czynniki inicjatorowe. Do tego kompleksu
przyłącza się podjednostka 50S. Związanie
mRNA
z rybosomem zaleŜy od tzw. sekwencji
Shine-Dalgarno (3 do 9 nukleotydów zlokalizowanych przed kodonem inicjacyjnym na
mRNA
). Ta sekwencja jest komplementarna do 3' końca 16S RNA rybosomu i pozwala
komórkom prokaryotycznym na translację policystronicznego
mRNA
. Proces inicjacji
rozpoczyna się przyłączeniem aminoacylo-
tRNA
do kodonu start. U bakterii inicjatorowym
aminoacylo-tRNA jest formylometionina. Terminacja syntezy białek zachodzi, gdy
osiągnięty zostanie kodon nonsensowny inaczej zwany kodonem stop. Białka uwalniają się, a
rybosom dysocjuje na dwie podjednostki.
Zgromadzenie powiązanych ze sobą funkcyjnie genów bakteryjnych w jednym miejscu
związane jest z regulacją przeprowadzaną przez specyficzne cząsteczki, umoŜliwiającą
kontrolę ekspresji genów jednego szlaku metabolicznego. Tego typu regulacja ekspresji
genów bakteryjnych bierze się z konieczności efektywnego wykorzystania ograniczonych
zapasów i energii oraz produkcji wyłącznie niezbędnych związków. Prawidłowo
funkcjonująca komórka bakteryjna nie powinna syntetyzować enzymów do metabolizmu
laktozy, jeŜeli brak jest laktozy w poŜywce. Podobnie bezsensowne byłoby produkowanie
enzymów do syntezy tryptofanu jeśli znajdowałby się on w wystarczającej ilości. Dlatego teŜ
komórki bakteryjne opracowały precyzyjne mechanizmy kontroli syntezy róŜnych związków
oparte na strukturze ich informacji genetycznej, w której geny odpowiedzialne za konkretny
szlak metaboliczny znajdują się w jednym miejscu i tworzą tzw. operon.
Pierwszym poznanym mechanizmem regulacji operonowej u bakterii jest proces rozkładu
laktozy u E.coli. Laktoza jest disacharydem ulegającym rozłoŜeniu na dwa cukry składowe:
galaktozę i glukozę, pod wpływem enzymu beta-galaktozydazy. Jeśli w środowisku nie ma
laktozy, w komórce E.coli znajduje się tylko kilka cząsteczek tego enzymu. Natomiast w
momencie, gdy w środowisku znajduje się laktoza, w komórce pojawiają się tysiące
cząsteczek beta-galaktozydazy. Dodatkowo zwiększa się w komórce ilość pozostałych
enzymów zaangaŜowanych w szlak laktozowy (galaktozydopermeazy i transacetylazy
galaktozydowej). KaŜdy z tych enzymów jest kodowany przez oddzielny gen jednak ich
ekspresja ulega wspólnej regulacji. Geny tych trzech enzymów znajdują się w jednym
liniowym odcinku na chromosomie E.coli i zostały oznaczone według kolejności
występowania:
•
Z - beta galaktozydaza
•
Y - beta galaktozydopermeaza (białko transportowe)
•
A - transacetylaza galaktozydowa.
Ekspresja wszystkich trzech genów podlegać moŜe jednoczesnej indukcji przez cząsteczkę
laktozy. Na tej podstawie stwierdzono, Ŝe przed tymi genami musi się znajdować niezaleŜny
element genetyczny, który reguluje ich ekspresję.
W końcu okazało się, Ŝe w regulacji szlaku metabolicznego laktozy bierze udział kilka
genów:
•
gen regulatorowy (gen lacI), który koduje cząsteczkę represora zdolną do przejścia w
inne miejsce, do operatora, gdzie indukuje ona sygnał wyłączający operon
•
gen operatora, który otrzymuje sygnał wyłączający z represora
•
trzy geny kodujące białka, które są transkrybowane na jedno
mRNA
•
promotor (częściowo nachodzący na gen operatorowy), gdzie przyłącza się RNA
polimeraza i indukuje syntezę
mRNA
Operon laktozowy, lac, działa w następujący sposób. Gen regulatorowy produkuje cząsteczkę
represora, która moŜe przenieść się do miejsca występowania operatora, przyłączyć się do
niego i zahamować transkrypcję genów strukturalnych w tym operonie. JeŜeli w pobliŜu nie
ma cząsteczek laktozy, cząsteczka represora przyjmuje konformację zdolną do związania się z
operatorem. Gdy represor zwiąŜe się z operatorem, promotor jest częściowo zasłonięty,
wobec czego polimeraza RNA nie moŜe się z nim związać i nie dochodzi do transkrypcji
mRNA
a następnie syntezy trzech białek. JeŜeli natomiast w środowisku obecna jest laktoza,
represor wiąŜe się z nią i przyjmuje inny kształt, który nie pozwala na połączenie się z
operatorem. Promotor pozostaje odsłonięty, wiąŜe się z polimerazą RNA i dochodzi do
ekspresji genów, które następnie prowadzą do rozkładu laktozy.
Jest to przykład regulacji ekspresji genów na poziomie transkrypcyjnym.
Ten mechanizm jest prosty i ładnie tłumaczy dlaczego komórka E.coli produkuje tylko tyle
beta-galaktozydazy ile jest jej potrzebne. Jednak w rzeczywistości sytuacja staje się nieco
bardziej skomplikowana gdyŜ komórka bakterii moŜe jednocześnie otrzymać laktozę i
glukozę. Co wtedy?
Dla bakterii korzystniejsze jest rozłoŜenie glukozy niŜ laktozy, poniewaŜ glukoza moŜe być
natychmiast zuŜyta w metabolizmie, a laktoza musi zostać najpierw rozłoŜona w
skomplikowanych reakcjach chemicznych. Bakteria zdolna do zuŜycia glukozy pomimo
obecności laktozy w poŜywce będzie rosła szybciej niŜ inne bakterie tym samym zdobywając
pewną nad nimi przewagę.
Dlatego teŜ nie naleŜy się dziwić, Ŝe powstał mechanizm tzw. represja kataboliczna, który
umoŜliwia bakterii zuŜywanie na początku glukozy, nawet gdy jest laktoza. Mechanizm
represji katabolicznej opiera się na fakcie, Ŝe polimeraza RNA łączy się z promotorem w
operonie lac duŜo lepiej w obecności specyficznego białka CAP (catabolite gene activator
protein), które musi być związane ze specyficznym miejscem DNA połoŜonym w pobliŜu
tzw.CBS (CAP binding site). Białko CAP wiąŜe się z tym miejscem jeśli do tego białka
przyłączą się cząsteczki cAMP, co zachodzi przy braku glukozy. JeŜeli natomiast glukoza
znajduje się w poŜywce, spada poziom cAMP, białko CAP zmienia kształt, nie wiąŜe się z
CBS, polimeraza RNA gorzej wiąŜe się z promotorem i synteza enzymów szlaku
laktozowego zostaje spowolniona.
Istnieją więc trzy róŜne poziomy aktywności operonu lac, zaleŜne od obecności laktozy i
glukozy w poŜywce oraz regulowane przez trzy róŜne białka: lac represor, polimerazę RNA i
CAP.
NajniŜszy poziom ekspresji zachodzi pod nieobecność laktozy: nie ma substratu, niepotrzebne
są enzymy do katalizy, represor lac jest połączony z operonem i blokuje wiązanie się
polimerazy RNA.
NajwyŜszy poziom ekspresji obserwuje się przy obecności laktozy, lecz braku glukozy:
laktoza wiąŜe represor uniemoŜliwiając mu związanie się z operatorem, co z kolei pozwala na
przyłączenie polimerazy RNA, a dodatkowo wysoki poziom cAMP i łączenie się go z CAP i
CAP z CBS co w rezultacie uaktywnia polimerazę RNA.
Model regulacji rozkładu laktozy w operonie lac jest jednym z wielu, jakie funkcjonują w
komórkach bakteryjnych. Jest to przykład pozytywnej regulacji ekspresji gdyŜ obecność
substratu w poŜywce indukuje produkcję enzymów.
Ponadto mamy do czynienia z innymi modelami regulacji ekspresji genów równieŜ
wynikającymi z dąŜenia komórki do efektywnego wykorzystania surowców, ale jednocześnie
nie nadprodukowania jakiejś substancji bez wyraźnej potrzeby. Ten typ mechanizmu regulacji
to represja, czyli zahamowanie syntezy enzymów szlaku biosyntetycznego w odpowiedzi na
nadmiar końcowego produktu. Przykładem operonu regulowanego w ten sposób jest operon
tryptofanowy (trp).
Operon tryptofanowy zawiera pięć genów (E,D,C,B,A) kodujących enzymy, które prowadzą
do syntezy
aminokwasu
- tryptofanu. W przypadku operonu tryptofanowego równieŜ mamy
do czynienia z cząsteczką represora kodowaną w niewielkiej odległości od operonu.
Cząsteczka represora trp podobnie jak lac moŜe istnieć w dwóch konformacjach: jedna
powoduje łączenie z operatorem i zablokowanie transkrypcji, natomiast druga konformacja
nie pozwala na związanie się represora z operatorem i umoŜliwia zajście transkrypcji. W
obecności tryptofanu cząsteczka represora wiąŜe się z tym
aminokwasem
i zmienia
konformację, na taką która umoŜliwia związanie się z operatorem i zablokowanie syntezy
enzymów.
JeŜeli tryptofan jest nieobecny, represor nie moŜe związać się z operatorem. Dochodzi wtedy
do przyłączenia polimerazy RNA i syntezy enzymów, które w następstwie doprowadzą do
syntezy tryptofanu. Oba opisane mechanizmy regulacji ekspresji genów czyli indukcja
operonu lac i represja operonu trp są przykładami na kontrolę negatywną. Oznacza to, Ŝe
ekspresja genów podlegających takiej kontroli zachodzi dopóki nie zostanie wyłączona przez
cząsteczkę represora.
Istnieje jeszcze model pozytywnej regulacji ekspresji genów, co z kolei oznacza, Ŝe geny
znajdujące się pod taką kontrolą ulegają ekspresji dopiero pod wpływem działania
specyficznego białka regulatorowego. Przykładem tego typu regulacji moŜe być opisana juŜ
wcześniej aktywacja kompleksu promotor-polimeraza RNA operonu lac przez wiązanie się
białka CAP do CBS.
Innym przykładem regulacji pozytywnej jest katabolizm maltozy u E.coli. Enzymy do
rozkładu maltozy są syntetyzowane dopiero po dodaniu maltozy do poŜywki. Ich synteza jest
regulowana na poziomie transkrypcji przez białko aktywujące (AP-activator protein). AP nie
moŜe związać się z DNA dopóki nie połączy się z cząsteczką maltozy. Gdy AP zwiąŜe się z
cząsteczką maltozy, kompleks taki łączy się z DNA i umoŜliwia polimerazie RNA
rozpoczęcie transkrypcji. Aktywator podobnie jak represor rozpoznaje specyficzną sekwencję
DNA tzw. miejsce wiązania aktywatora. Geny potrzebne do katabolizmu maltozy znajdują się
w kilku operonach wobec czego aktywator kontroluje więcej niŜ jeden operon. Grupa
operonów regulowanych przez jedno białko aktywujące nazywana jest regulonem.
Atenuacja
Atenuacja jest typem regulacji opartym na fakcie, Ŝe w organizmach prokariotycznych
transkrypcja i translacja są procesami wzajemnie połączonymi. Atenuacja została
zaobserwowana w niektórych operonach kontrolujących biosyntezę
aminokwasów
. Najlepiej
zbadanym przykładem jest atenuacja w operonie tryptofanowym. Poza wspomnianymi juŜ
wcześniej genami i strukturami znajdującymi się w tym operonie, operon ten zawiera tzw.
sekwencję liderową, w obrębie której znajduje się region atenuatora kodujący polipeptyd
zawierający przy końcu kodony tryptofanu. JeŜeli w komórce znajduje się duŜo tryptofanu
peptyd liderowy zostanie zsyntetyzowany. Natomiast przy braku tryptofanu nie powstanie
peptyd liderowy. Jakie są tego rezultaty?
Synteza peptydu liderowego prowadzi do zahamowania transkrypcji genów tryptofanowych.
W jaki sposób?
Proces ten jest moŜliwy ze względu na fakt, Ŝe transkrypcja i translacja w komórkach bakterii
zachodzi praktycznie jednocześnie. Sekwencja liderowa jako pierwsza ulega transkrypcji i
gdy następnie transkrypcja idzie dalej,
mRNA
sekwencji liderowej ulega juŜ translacji.
JednakŜe w przypadku
mRNA
sekwencji liderowej, gdy jest juŜ uwolnione z DNA i połączy
się z rybosomem ulega ono sfałdowaniu w podwójną pętlę, która sygnalizuje zatrzymanie
transkrypcji dalszych genów (tryptofanowych). Jeśli nie ma tryptofanu to nie dojdzie do
translacji całej sekwencji liderowej gdyŜ zostanie ona zatrzymana na kodonie tryptofanowym,
co powoduje przyjęcie innej konformacji przez
mRNA
sekwencji liderowej. Ta konformacja
nie blokuje polimerazy RNA, która przechodzi dalej do transkrypcji genów tryptofanowych.
Mechanizmy represji i atenuacji operonu tryptofannowego w precyzyjny sposób kontrolują
syntezę enzymów szlaku biosyntezy tryptofanu. Podobne modele atenuacji odkryto w innych
szlakach metabolicznych bekterii np. w biosyntezie histydyny czy fenyloalaniny.
Antysensowne RNA
Większość systemów kontrolujących czy to transkrypcję czy translację wykorzystuje białka
jako cząsteczki regulatorowe. Jednak niekiedy zdarza się, Ŝe w regulację zostanie
zaangaŜowane RNA. Jednym z rodzajów regulatorowego RNA jest RNA antysensowne
uŜywane w kontroli róŜnych genów bakteryjnych. Antysensowne RNA oddziałuje jako
regulator poprzez parowanie z komplementarną, sensowną nicią RNA. JeŜeli tą
komplementarną nicią jest
mRNA
, to parowanie z antysensownym RNA moŜe zapobiec
zajściu translacji. Antysensowne RNA moŜe być syntetyzowane z tego samego genu, co
mRNA
przez zastosowanie drugiego promotora zorientowanego w przeciwnym kierunku do
pierwszego lub poprzez drugi gen z promotorem na przeciwnym końcu.
PLAZMIDY
Plazmidy są to elementy genetyczne zdolne do autonomicznego powielania się i istnienia
pozachromosomalnego. Większość plazmidów ma koliste, superzwinięte dsDNA, a niektóre
liniowe dsDNA. Wiele plazmidów moŜe być przenoszonych w procesie koniugacji z jednej
do drugiej komórki. Niektóre plazmidy mają zdolność do wintegrowywania się w chromosom
bakteryjny i wtedy ich replikacja podlega kontroli bakterii.
Jednym z najlepiej poznanych plazmidów jest plazmid F z E.coli. Jest tp plazmid typu
koniugacyjnego i moŜe być transferowany z komórki donora do akceptora nawet z
fragmentami chromosomalnego DNA donora. Plazmid F jest kolistą cząsteczką (dł.100bp) i
zawiera róŜne geny niezbędne do procesu replikacji i transferu , a ponadto sekwencje, które
pozwalają na rekombinację z chromosomem bakteryjnym w celu utworzenia Hfr. Plazmidy
zdolne do integracji w chromosom gospodarza nazywane są episomami.
Większość plazmidów w bakteriach gramujemnych przechodzi replikację dwukierunkową
według modelu theta z zastosowaniem enzymów komórkowych. Natomiast plazmidy bakterii
gramdodatnich w większości replikują według modelu obracającego się koła. Plazmidy, które
posiadają materiał genetyczny w formie liniowej replikują w sposób podobny do
adenowirusów. Pomimo, Ŝe plazmidy są niezaleŜnie replikującymi elementami genetycznymi,
ilość ich cząsteczek w komórce jest do pewnego stopnia określona przez daną komórkę a
ponadto przez warunki zewnętrzne. Plazmidy są w biologii molekularnej bardzo istotnym
narzędziem słuŜącym do badania róŜnorodnych procesów genetycznych czy ekologii i Ŝycia
bakterii. Ponadto stosowane są w biotechnologii. Obecność plazmidów w komórce moŜe mieć
znaczny wpływ na jej fenotyp np. u Rhizobium to plazmidy umoŜliwiają współdziałanie z
roślinami.
Ze względu na zróŜnicowanie wielkości plazmidów oraz posiadanych przez nie genów na:
•
produkcję toksyn
•
uodpornienie komórki gospodarza na antybiotyki i inne substancje
•
katabolizm nietypowych substratów np. pestycydów
•
kontrolę procesu koniugacji
i wiele innych. Nie jest łatwo sklasyfikować plazmidy według jakiejś charakterystycznej
cechy, jednak dokonuje się podziału na pewne grupy.
Plazmidy koniugacyjne
Plazmidy te mają zdolność do przenoszenia się z komórki donora do akceptora w procesie
koniugacji. Za ten proces odpowiedzialne są geny w regionie tra znajdujące się w plazmidach.
Geny te związane są między innymi z syntezą pili np. F i I
Pili typu F biorą udział w transferze plazmidu F oraz niektórych plazmidów z odpornością na
antybiotyki. Pili typu I są zaangaŜowane w przenoszenie plazmidów z opornością na
antybiotyki i innymi właściwościami.
Plazmidy opornościowe (R - resistance)
Plazmidy te nadają komórce oporność na antybiotyki i inne inhibitory wzrostu. Plazmidy R
mogą posiadać róŜnorodne geny oporności na antybiotyki. Geny te kodują zazwyczaj białka
które inaktywują antybiotyk albo wpływają na pobranie antybiotyku przez komórkę. Plazmid
R100 niesie oporność na sulfonamidy, streptomycynę, tetracyklinę, chloramfenikol i inne.
Plazmid ten moŜe być przenoszony pomiędzy bakteriami z Enterobakteriaceae: Escherichia,
Klebsiella czy Salmonella.
Poza tym znane są plazmidy z opornością na kanamycynę, penicylinę czy neomycynę.
Ponadto plazmidy typu R posiadają geny, które hamują wprowadzanie plazmidu tego samego
typu do komórki, plazmid dodatkowy zostaje zgubiony w procesie replikacji, co nie
przeszkadza współistnieć w jednej komórce plazmidom z dwóch róŜnych grup. MoŜliwa jest
rekombinacja genetyczna pomiędzy dwoma R, co moŜe prowadzić do powstania organizmów
opornych na wiele leków. Plazmidy R są odpowiedzialne za uzyskiwanie przez bakterie
chorobotwórcze oporności na leki (antybiotyki). Komórki bakteryjne mogą wymieniać
między sobą materiał genetyczny w trzech procesach, które zachodzą naturalnie: koniugacja,
transdukcja i transformacja. mechanizmy przekazywania materiału genetycznego nie są
związane z procesem reprodukcji komórki bakteryjnej, zachodzą one w konkretnych
warunkach i polegają na przekazaniu niewielkiej części materiału genetycznego z komórki
dawcy do biorcy.
REKOMBINACJA DNA U BAKTERII
•
Proces rekombinacji jest to przeprowadzanie wymiany pomiędzy homologicznymi
odcinkami DNA. Jest to podstawowy mechanizm wymiany genów pomiędzy
chromosomami w Ŝywych organizmach. Powoduje on zwiększenie róŜnorodności
genetycznej, a ponadto w sytuacjach ekstremalnych przy duŜym zniszczeniu DNA
umoŜliwia przeŜycie organizmu.
W trakcie rekombinacji u bakterii uczestniczy specyficzne białko RecA. Białko to ma
zdolność do niespecyficznego (czyli niezaleŜnego od sekwencji) wiązania się z
jednoniciowym DNA. Następnie kompleks białko- DNA atakuje losowo drugą cząsteczkę
DNA, powodując rozplecenia nici. JeŜeli natrafi na sekwencję komplementarną to
zapoczątkowuje powstanie DNA rekombinowanego z nici atakującej i atakowanej. Powstaje
przejściowa struktura krzyŜowa (rysunek). Po czym struktura ta zostaje pocięta przez
endonukleazy i powstają dwie zrekombinowane cząsteczki DNA.
W organizmach bakteryjnych rekombinacja zachodzi na trzy sposoby:
•
koniugacja
•
transformacja
•
transdukcja
Koniugacja
Koniugacja u bakterii jest to proces transferu genetycznego zachodzący podczas kontaktu
dwóch komórek. Przenoszonym materiałem genetycznym moŜe być plazmid lub fragment
chromosomu, który jest transferowany dzięki plazmidowi. W koniugacji jedna z komórek
tzw. donor przekazuje informację genetyczną komórce biorcy. Komórka dawcy posiada
specyficzną strukturę powierzchniową tzw. pilus płciowy, który pozwala na kontakt
pomiędzy komórkami. Natomiast komórka biorcy posiada na swej powierzchni specyficzne
receptory dla pilusa płciowego. Znane są dwa typy dawców:
•
F+ plazmid w tej komórce funkcjonuje jak typowy plazmid i tylko on jest
przenoszony w procesie koniugacji
•
Hfr plazmid jest wintegrowany w chromosom dawcy i umoŜliwia on przekazanie
DNA chromosomalnego podczas koniugacji.
Gdy komórki koniugujące juŜ się ze sobą zetkną, zostaje zainicjowana synteza DNA i
zachodzi przejście pojedynczej nici DNA z jednej do drugiej komórki. Synteza DNA w obu
komórkach prowadzi do zachowania dwuniciowej natury DNA i zapewnia zachowanie pełnej
informacji genetycznej w komórce dawcy. Przekazanie materiału genetycznego zachodzi
sekwencyjnie zaczynając od określonego miejsca w chromosomie dawcy.
Transfer DNA z F
+
do F
-
Podczas koniugacji musi zajść synteza DNA. Odbywa się to według modelu obracającego się
koła. Koliste DNA plazmidowe zostaje nacięte i jedna nić rodzicielska jest przekazywana do
komórki biorcy.
Gdy komórki koniugujące juŜ się ze sobą zetkną, zostaje zainicjowana synteza DNA i
zachodzi przejście pojedynczej nici DNA z jednej do drugiej komórki. Synteza DNA w obu
komórkach prowadzi do zachowania dwuniciowej natury DNA i zapewnia zachowanie pełnej
informacji genetycznej w komórce dawcy. Przekazanie materiału genetycznego zachodzi
sekwencyjnie, w konkretnym miejscu na chromosomie dawcy. Koniugacja pomiędzy
komórkami typu F
+
i F
-
, zachodzi podobnie do modelu replikacji obracającego się koła. Gdy
dojdzie do kontaktu pomiędzy dwiema komórkami, zostaje nacięte DNA plazmidowe i jedna
nić jest przekazywana do komórki biorcy. Synteza DNA według modelu obracającego się
koła odbudowuje drugą nić DNA u dawcy. Podobnie komplementarna nić jest tworzona u
biorcy.
Obecność plazmidu F w komórce powoduje róŜne zmiany:
•
komórka ma zdolność do syntezy pilii płciowych
•
istnieje moŜliwość przeniesienia fragmentów DNA do innej komórki
•
zmiana receptorów komórkowych uniemoŜliwiająca pobieranie kolejnych plazmidów
Plazmid moŜe być zintegrowany z chromosomem w konkretnych miejscach, które
charakteryzują się homologią DNA komórkowego do plazmidowego. Po zintegrowaniu
plazmidu mamy do czynienia z komórką typu Hfr (high frequency of recombination), która
nie moŜe w koniugacji przekształcić komórki F
-
w F
+
lub Hfr, poniewaŜ bardzo rzadko
zachodzi w takich sytuacjach transfer całego plazmidu.
(Szczegółowe wyjaśnienie procesu w prezentacji z wykładu)
W procesie koniugacji przerywanej przeprowadzanym doświadczalnie moŜliwe jest
zmapowanie ułoŜenia genów na chromosomie.
Transdukcja
W procesie transdukcji DNA między bakteriami jest przekazywane przy udziale
bakteriofagów. WyróŜniamy dwa typy transdukcji: ogólną i ograniczoną. Transdukcja
ogólna polega na przeniesieniu przez faga dowolnych genów zlokalizowanych w
przypadkowym miejscu w genomie bakterii do komórki biorcy, z niską efektywnością.
Transdukcja ograniczona występuje tylko w przypadku fagów łagodnych i polega na tym,
Ŝ
e fag wintegrowuje się w specyficzne miejsce w genomie bakterii, następnie jako profag jest
replikowany wraz z genomem komórki gospodarza. Potem zachodzi proces uwolnienia
profaga, który moŜe być na tyle nieprecyzyjny, Ŝe spowoduje wycięcie profaga wraz z
pobliskim fragmentem chromosomu. Kolejnym etapem jest liza komórki i uwolnienie
cząsteczek fagowych z konkretnymi fragmentami chromosomów. FIG 7 16 7 17
Transformacja
Transformacja jest to proces pobierania przez komórki bakteryjne wolnego DNA z podłoŜa
lub uwolnionego przez inne bakterie. Niektóre komórki mają naturalną zdolność do
przeprowadzania tego procesu dzięki specyficznym systemom w błonie, ułatwiającym
pobranie DNA. Są to tzw. bakterie kompetentne. W inŜynierii genetycznej stosuje się róŜne
metody umoŜliwiające równieŜ innym bakteriom przeprowadzenie transformacji. Podczas
pojedynczej transformacji moŜe dojść do pobrania niewielkiej ilości DNA, która jednak
wydatnie rośnie przy zastosowaniu bakterii kompetentnych.