Ćw. 5 – Antygeny zgodności tkankowej.  

Test mikrolimfocytotoksyczny wg Terasaki. 

 

Antygeny zgodności tkankowej – glikoproteiny powierzchniowe obecne w błonach komórkowych, 
występują u kręgowców, są odpowiedzialne za odrzucanie przeszczepów allogenicznych. 

•  MHC – Major Histocompatibility Complex – zespół genów kodujących antygeny zgodności 

tkankowej, położonych u człowieka na chromosomie 6. 

•  HLA – Human Leukocyte Antigens – antygeny zgodności tkankowej występujące u człowieka. 

Długośd przeżycia przeszczepów narządowych jest uwarunkowana stopniem zgodności HLA 
między dawcą a biorcą przeszczepu (antygeny transplantacyjne).  

Rys. Schemat mapy genetycznej układu HLA. 

 

 

 
Klasy MHC: 

 

MHC klasy pierwszej

:  

•  prezentują antygeny limfocytom Tc, doprowadzając do lizy komórki 

zainfekowanej np. wirusami lub bakteriami wewnątrzkomórkowymi, 
np. Listeria monocytogenes, Mycobacterium tuberculosis  

•  występują na powierzchni wszystkich komórek jądrzastych (nieliczne na 

erytrocytach) 

•  są kodowane przez polimorficzne geny okupujące trzy loci: HLA-A, HLA-B, HLA-C, w obrębie 

każdego locus opisano od kilku do kilkunastu swoistości antygenowych 

•  u człowieka  ze względu na diploidalny komplet chromosomów i dziedziczenie MHC jako 

cechy kodominującej zwykle wykrywa się po dwa antygeny z każdego locus  

•  Budowa: 

- 

łaocuch ciężki – α (45 kDa) 
  fragment zewnątrzkomórkowy - 3 domeny    α

1

, α

2 

(tworzą 

rowek wiążący 

9aa antygen

 ), α

3

 

 

fragment hydrofobowy – częśd transbłonowa  

 

fragment hydrofilowy – częśd cytoplazmatyczna 

- 

łaocuch  lekki  –  β2-mikroglobulina  (β2m)  (12  kDa)  –  kodowany 
przez gen na chromosomie 15, czynnik „wyciągający” łaocuch α na 
zewnątrz komórki 

 

 

MHC klasy drugiej

:  

•  prezentują antygen limfocytom Th, doprowadzając do aktywacji układu 

immunologicznego poprzez wpływ na: 

- 

odpowiedź humoralną: Th2 - IL-4, IL-5 IL-6 

- 

odpowiedź komórkową: Th1 – IL-2, IFN-γ, TNF-α, TNF-β  

•  występują na powierzchni limfocytów B, makrofagów, komórek 

dendrytycznych i nabłonkowych grasicy 

•  są kodowane w regionie D, który składa się z kilkunastu blisko 

położonych loci, zgrupowanych w subregiony: HLA-DP, HLA-DQ, HLA-DR 

•  wykryto kilkaset swoistości antygenowych kodowanych przez te geny 

•  Budowa: 

- 

łaocuch α (33 kDa) i łaocuch β (29 kDa) – częśd 
wewnątrzkomórkowa, transbłonowa i zewnątrzkomórkowa 

- 

częśd zewnątrzkomórkowa – domeny α

1

 i α

2

 oraz β

1

 i β

2

 

- 

domeny α

1

 i β

1

 – tworzą rowek wiążący 20aa antygen 

 

 

MHC klasy trzeciej

:  

•  Składowe dopełniacza: C4, C2, B 
•  Występują w plazmie krwi i odgrywają niewielką rolę w odrzucaniu przeszczepów  

 

Funkcje MHC: 

•  Główna funkcja MHC to wiązanie i prezentacja antygenu limfocytom T 

•  Heterozygoty wykazują lepszą możliwośd prezentacji większej ilości antygenów, a 

polimorfizm MHC zwiększa przeżycie niektórych osobników w populacji podczas epidemii 
śmiertelnych chorób 

!!! 

 

•  Różnorodnośd cząsteczek MHC jest wynikiem przystosowania się układu immunologicznego 

do walki z mikroorganizmami  

Metody identyfikacji HLA: 

•  Typowanie serologiczne oparte na przeciwciałach anty-HLA, najczęściej monoklonalnych (np. 

test Terasaki) 

•  Typowanie genetyczne określające polimorfizm na poziomie DNA 
•  Analiza fragmentów restrykcyjnych produktu PCR (PCR-RFLP) i porównanie z określonymi 

wzorcami  

 

Typowanie HLA jest istotne w: 

- 

transplantologii 

- 

diagnostyce chorób powiązanych z HLA (np. korelacja między ekspresją HLA-B27 a 
zesztywniającym zapaleniem kręgosłupa) 

- 

ustalaniu ojcowstwa 

- 

medycynie sądowej  

Test mikrolimfocytotoksyczny wg. Terasaki (wykrywanie HLA kl. I) 

Izolacja limfocytów - wykonanie: 

1.  Odwłóknioną przez wytrząsanie z perełkami szklanymi krew rozcieoczono PBS w stosunku 1:1 
2.  Otrzymaną zawiesinę nawarstwiono na Lymphoprep w proporcji 2:1 (np. 6ml krwi i 3ml 

Lymphoprepu) i wirowano przez 15 min (400xg) 

3.  Zebrano limfocyty z interfazy (pierścieo znajdujący się między Lymphoprepem a osoczem) i 

płukano je 2-3x PBSem oraz rozcieoczono PBS do gęstości 2x10

6 

 kom/ml 

4.  Limfocyty kontrolne, przechowywane w ciekłym azocie  odmrożono przez zanurzenie 

ampułki w wodzie o temp. 37°C, następnie płukano PBS i przygotowano zawiesinę o gęstości 
2x10

6 

 kom/ml  

Test Terasaki - wykonanie: 

1.  72-dołkowe płytki Terasaki na których przeprowadza się test należy odpowiednio oznakowad 

i wszystkie zagłębienia wypełnid do 2/3 objętości olejem parafinowym (uwaga! na dnie 
zagłębieo nie może byd pęcherzyków powietrza) 

2.  Do każdego zagłębienia, pod parafinę, wkrapla się przy pomocy mikrostrzykawki Hamiltona o 

pojemności 50 µl po 1 µl surowicy wzorcowej anty-HLA (uwaga! Przy każdej zmianie surowicy 
strzykawkę trzeba dokładnie przepłukad w PBS (10x), aby uniknąd przeniesienia surowicy z 
jednego dołka do drugiego) 

3.  Zagłębienie oznaczone 

1A

 przeznaczone jest na kontrolę żywotności limfocytów, więc 

zamiast surowicy wzorcowej dodajemy tu 1 µl PBS 

(kontrola negatywna)

 natomiast do dołka 

1B

 dodajemy wzorcowe limfocyty i wybraną wzorcową surowicę 

(kontrola pozytywna)

 

4.  Do wszystkich dołków (z wyjątkiem 1B) dodajemy po 1 µl zawiesiny badanych limfocytów o 

gęstości 2x10

3 

 kom/1 µl PBS 

5.  Płytki inkubujemy z wytrząsaniem przez 30 min w 20°-24°C 
6.  Następnie do każdego dołka dodajemy po 5 µl króliczego dopełniacza i inkubujemy próbki z 

wytrząsaniem przez 60 min w 20°-24°C 

7.  Po inkubacji do każdego dołka dodajemy po 5 µl 5% roztworu eozyny żółtawej, a po 3 min po 

5 µl 38% roztw. formaldehydu  

 

          

 

Dopełniacz łączy się z komórkami opłaszczonymi przeciwciałami i powoduje ich lizę. W dołkach, w 

których limfocyty uległy zniszczeniu zaszła reakcja pomiędzy antygenem HLA a skierowanym 

przeciw niemu przeciwciałem- wynik dodatni.