Ćwiczenie 10

Ćwiczenie 10.

Diagnostyka pałeczek Gram-ujemnych niefermentujących glukozy.

Diagnostyka bakterii beztlenowych

I. Pałeczki niefermentujące glukozy są to pałeczki tlenowe, nie wytwarzające przetrwalników, które
charakteryzuje brak zdolności fermentacji glukozy, tzn. rozkładania glukozy bez udziału tlenu.

Klasyfikacja pałeczek Gram-ujemnych niefermentujących (wybrane rodzaje, mające znaczenie w
zakażeniach człowieka)

Rodzaj:

Pseudomonas

około 100 gatunków

Gatunek: P. aeruginosa

P. fluorescens

P. putida

Rodzaj:

Burkholderia

około 30 gatunków

Gatunek: B. mallei

B. pseudomallei

B. cepacia

B. gladioli

Rodzaj: Ralstonia

Gatunek: R. picketti

Rodzaj:

Stenotrophomonas

5 gatunków

Gatunek: S.maltophilia

Rodzaj:

Alcaligenes

4 gatunki

Gatunek: A. faecalis

Rodzaj: Achromobacter

7 gatunków

Gatunek: A. xylosoxidans

Rodzaj: Chryseobacterium

Gatunek: Ch. indologenes

Ch. meningosepticum

Rodzaj: Flavobacterium

13 gatunków

Gatunek: F. meningosepticum

Rodzaj

: Acinetobacter

16 gatunków

Gatunek: A. baumannii

A. lwoffii

A. calcoaceticus
A. haemolyticus

Pałeczki niefermentujące glukozy są obecnie częstą przyczyną zakażeń szpitalnych pacjentów z chorobami
zagrażającymi życiu i z obniżoną odpornością organizmu.
Wywołują one: - posocznice

zakażenia układu oddechowego

septyczne zapalenie stawów

zakażenia układu moczowego

pooperacyjne i pourazowe zakażenia ran

zapalenie spojówek i inne

Miejscem ich naturalnego występowania jest woda, gleba, ścieki i żywność. Mogą rozwijać się w ubogich w
składniki  odżywcze  środowiskach.  Stanowią  również  składnik  mikroflory  skóry  (pachy,  pachwiny,
przestrzenie  międzypalcowe)  i  są  często  przenoszone  na  rękach  pacjentów  i  personelu  szpitalnego
(Acinetobacter!).
Charakteryzują  się  wieloraką  opornością  na  antybiotyki.  Niektóre  (np.  Acinetobacter)  są  oporne  na
wszystkie  betalaktamy  z  grupy  penicylin,  inne  (np.  Stenotrophomonas  maltophilia)  na  imipenem  lub
(Burkholderia cepacia) na gentamycynę.

Identyfikacja
Uwzględnia się takie cechy biochemiczne jak:



zdolność do fermentacji i oksydacji glukozy



zdolność do wzrostu na podłożu Mac Conkeya



aktywność oksydazy cytochromowej



ruch



wytwarzanie barwnika



hydroliza mocznika



redukcja azotanów



wytwarzanie indolu



dekarboksylacja aminokwasów



hydroliza eskuliny

W praktyce wykorzystuje się gotowe zestawy umożliwiające identyfikację do gatunku np. API 20NE, ID 32
GN w ramach systemu ATB Expression firmy bioMerieux, karty GN do systemu Vitek 2 compact.

1. Pseudomonas aeruginosa
Pałeczka ropy błękitnej, tlenowa, szeroko rozpowszechniona w przyrodzie (gleba, woda, ścieki, rośliny,
owady, zwierzęta), chorobotwórcza dla roślin, owadów i zwierząt.
Zakażenia przez nią wywoływane najczęściej rozpoczynają się w miejscach wilgotnych np.

przy rurce tracheotomijnej

cewnikach

w miejscach oparzeń

uchu zewnętrznym („ucho pływaka”)

w ranach

zakażenia dróg moczowych

zakażenia dolnych dróg oddechowych

zapalenie rogówki, zakażenie wrzodu rogówki, zakażenie głębokie gałki ocznej

bakteriemie i posocznice

zapalenie wsierdzia

zapalenie opon mózgowo-rdzeniowych

ropnie mózgu

zakażenia kości i/lub stawów

endocarditis

Wytwarza barwniki fenazynowe, rozpuszczalne w wodzie i dyfundujące do podłoża:

fluoresceina (piowerdyna) – barwnik fluoryzujący

piocyjanina (barwnik niebieski)

piorubryna (czerwony)

melanina (brązowy)

Szczepy szpitalne Pseudomonas aeruginosa mogą nie wytwarzać barwników!
Czynniki, które decydują o chorobotwórczości Pseudomonas aeruginosa:

egzotoksyna A

enterotoksyna (enteritis, biegunka 5-dniowa w klimacie tropikalnym)

ciepłochwiejna fosfolipaza C (lecytynaza)

ciepłostały glikolipid wywołujący hemolizę krwinek w temp. 22-37

leukocydyna (uwalniana po lizie komórek – cytotoksyczne działanie na ludzkie
leukocyty)

enzymy proteolityczne (elastaza, kolagenaza, żelatynaza, fibrynolizyna)

- otoczka alginianowa, która jest zbudowana z polimeru kwasów mannurowego i

glukuronowego. Szczepy wydzielające ten związek mają wygląd śluzowaty (połyskujący).

Rutynowa diagnostyka Pseudomonas aeruginosa

posiew materiału na



podłoże  wybiórcze  z  cetrymidem  (bromek  cetylotrójmetyloamonowy  0.02%  i  kwas
nalidyksowy  15  mg/l  jako  czynniki  selektywne)  może  służyć  do  bezpośredniego
posiewu  kału,  ropy  lub  moczu;  zalecane  do  wykrywania  P.  aeruginosa  w  żywności  i
wodzie; używane zarówno w badaniach systematycznych w warunkach szpitalnych, jak i
w  przemyśle  –  zanieczyszczenie  powierzchni,  aparatury,  przyrządów,  środków

antyseptycznych itd.) – obserwacja wytworzenia piocyjaniny i fluoresceiny (w
świetle lampy UV) po inkubacji 24-48 godzinnej w temp. 35



podłoże King B z nitrofurantoiną (zahamowanie rozwoju większości pałeczek Gram-
ujemnych) – po 24 godzinnej inkubacji w temp. 35-37

C obserwacja w świetle lampy

UV zielonej, niebieskiej lub zielono-żółtej fluorescencji

Pseudomonas  aeruginosa  wzrasta  również  na  zwykłym  podłożu  agarowym  i  agarowym  z  dodatkiem  5%
krwi  baraniej,  tworząc  duże,  szarobrązowożółte  kolonie  (Morfologia  kolonii:  S-gładka,  R-szorstka,  M-
śluzowa). Otoczenie kolonii zazwyczaj wybarwione jest na kolor żółtozielony lub zielononiebieski.
Zapach: miodu lub jaśminu (trimetyloamina).

preparat barwiony metodą Grama – Pseudomonas aeruginosa to pałeczka Gram-
ujemna.

wzrost w temp. 42

C - Pseudomonas aeruginosa wzrasta w tej temp. w podłożu

bulionowym.

wykrywanie piocyjaniny w podłożu płynnym – warstwa chloroformu dodanego do 24h
hodowli bulionowej zabarwia się na kolor zieloniebieski; na powierzchni hodowli
widoczna jest błonka. Powyższe obserwacje charakterystyczne są dla Pseudomonas
aeruginosa.

wykrywanie  ruchu  -  w  półpłynnym  podłożu  z  dodatkiem  TTC  (chlorek
trójfenylotetrazoliwy) –  Pseudomonas aeruginosa wykazuje wzrost i zaczerwienienie w
górnej części podłoża i wzdłuż linii wkłucia. Jest urzęsiony biegunowo.

wykrywanie oksydazy cytochromowej – odczynnik tetrametylo-p-fenylodiamina
reaguje z cytochromem c wytwarzając składnik koloru niebieskiego



metoda probówkowa: zawiesić badany szczep, z 18-24h hodowli stałej, w jałowej wodzie destylowanej,

a następnie dodać w/w odczynnik; w ciągu 30s do 2 min. szczep wytwarzający oksydazę powoduje
powstanie intensywnego niebieskiego zabarwienia



metoda bibułowa: na krążek bibuły filtracyjnej umieszczonej w płytce Petriego nanieść 2-4 krople
odczynnika, a następnie za pomocą bagietki nanieść na bibułę z odczynnikiem badany szczep z 18-24h
hodowli stałej; w ciągu 30s do 2 min. szczep wytwarzający oksydazę powoduje powstanie intensywnego
niebieskiego zabarwienia



testy komercyjne: Bactident Oxidase (Merck)

Oxidase test

(bioMerieux)

Dry-slide oxidase (Difco)

Pseudomonas aeruginosa jest pałeczką oksydazo-dodatnią.

- rozkład glukozy (O/F) na podłożu Hugh-Leifsona zawierającym 1% glukozę oraz błękit

bromotymolowy jako wskaźnik barwny; badany szczep posiewa się do dwóch probówek z
podłożem Hugh-Leifsona, jedną z nich zalewa się jałową parafiną; inkubacja w temp. 35-37

C 24

godziny do 5 dni;

zdolność do fermentacji glukozy (F) – zmiana zabarwienia do żółtego występuje w obu
probówkach (z parafiną i bez parafiny);
zdolność do oksydacji glukozy (O) – zmiana zabarwienia do żółtego tylko w probówce
bez parafiny

Pseudomonas aeruginosa powoduje oksydację glukozy.

redukcja azotanów do azotynów - na podłożu o specjalnym składzie w obecności
odczynników:



-naftolu w lodowatym kwasie octowym i kwasu sulfanilowego w

lodowatym kwasie octowym;
zdolność redukcji azotanów do azotynów – powstanie czerwonego zabarwienia w ciągu
5 minut;

zdolność redukcji azotanów do wolnego azotu – brak czerwonego zabarwienia po
dodaniu sproszkowanego cynku, gdy nie wystąpiła w/w reakcja;
brak zdolności redukcji azotanów do azotynów – czerwone zabarwienie po dodaniu
sproszkowanego cynku

Pseudomonas aeruginosa redukuje azotany do wolnego azotu, ale niektóre szczepy mogą redukować
azotany do azotynów.

wytwarzanie dihydrolazy argininy - enzym rozkłada argininę do ornityny,
amoniaku i CO

, co powoduje wzrost pH (zmiana zabarwienia wskaźnika-czerwieni

fenolowej z żółtej na czerwoną). Pseudomonas aeruginosa wytwarza dihydrolazę
argininy.

redukcja TTC - powstaje czerwony strąt (formazon) w hodowli płynnej lub czerwono
zabarwione kolonie z metalicznym połyskiem na podłożu agarowym. Są to reakcje
charakterystyczne dla Pseudomonas aeruginosa.

identyfikacja do gatunku za pomocą biochemicznych mikrotestów komercyjnych: API
20 NE i ID 32 GN w ramach systemu ATB Expression, kart GN w systemie Vitek 2
compact (bioMerieux)

typowanie pałeczek P. aeruginosa dla celów epidemiologicznych (identyfikacja
wewnątrzgatunkowa): serologiczne, bakteriofagowe, bakteriocynowe (piocynowe),
biochemiczne, enzymatyczne, genetyczne.

Pałeczki  P.  aeruginosa  charakteryzuje  naturalna  oporność  na  liczne  leki  (penicylina  G,  ampicylina,
amoksycylina z kwasem klawulanowym, cefalosporyny I-II generacji, tetracykliny/tigecyklina, linkozamidy,
stare chinoliny, ertapenem, chloramfenikol, kanamycyna i neomycyna, trimetoprim).
Aktywne mogą być: karbenicylina, tikarcylina, ureidopenicyliny (piperacylina), aztreonam (monobaktamy),
ceftazydym  i  cefoperazon  (cefalosporyny  III  generacji),  cefpirom  (IV  generacja  cefalosporyn),  imipenem i
meropenem  (karbapenemy),  Timentin  i  Tazocin  (preparaty  skojarzone),  aminoglikozydy  i  fluorochinolony
(wysokie odsetki szczepów opornych).

2. Acinetobacter spp.
Gram-ujemna  ziarniako-podobna-pałeczka,  tlenowa,  szeroko  rozpowszechniona  w  przyrodzie  (środowisko
wodne,  gleba,  żywność,  u  ludzi  i  zwierząt).  U  człowieka  bytuje  na  skórze  (pachy,  pachwiny,  przestrzenie
między palcami nóg), rzadziej kolonizuje przewód pokarmowy, jamę nosowo-gardłową i pochwę.
Wywołuje  zakażenia  u  chorych  o  zmniejszonej  odporności,  po  zabiegach  inwazyjnych,  ciężkich  i
długotrwałych zabiegach chirurgicznych. Jest to drobnoustrój powodujący typowe zakażenia szpitalne. Może
wywoływać:

zakażenia dolnych dróg oddechowych (chorzy intubowani)

bakteriemie i posocznice

zapalenie otrzewnej (u chorych dializowanych)

zakażenia układu moczowego (chorzy z cewnikami założonymi na stałe)

zapalenie opon mózgowych (po zabiegach neurochirurgicznych)

zapalenie spojówek i/lub gałki ocznej

zapalenie wsierdzia

zapalenie stawów, kości i szpiku

zakażenia skóry i ran

Nie wytwarza barwników (obserwowano powstawanie brązowego barwnika przechodzącego do podłoża
wyłącznie na agarze z wyciągiem z serca wołowego).
Diagnostyka:

preparat barwiony metodą Grama – Acinetobacter to Gram-ujemna ziarniako-
podobna-pałeczka

wzrost na podłożach – Acinetobacter dobrze rośnie na podłożu MacConkeya (z
wyjątkiem nielicznych szczepów A. lwoffii), na zwykłym podłożu agarowym i na
podłożu agarowym z krwią

wykrywanie ruchu – Acinetobacter nie wykazuje ruchu (brak urzęsienia)

wykrywanie oksydazy cytochromowej – Acinetobacter to pałeczka oksydazo-ujemna

rozkład glukozy (O/F) – niektóre szczepy powodują

rozkład tlenowy glukozy na

podłożu Hugh-Leifsona, inne mogą być asacharolityczne.

redukcja azotanów do azotynów – Acinetobacter nie wykazuje zdolności redukcji
azotanów do azotynów

wytwarzanie dihydrolazy argininy – Acinetobacter nie wytwarza dihydrolazy argininy

W identyfikacji do gatunku wykorzystuje się testy fenotypowe, np. API 20 NE lub ID 32 GN bioMerieux.,
karty GN w systemie Vitek 2 compact.

Obecnie wyróżnia się 12 gatunków genetycznych wyodrębnionych dzięki technice hybrydyzacji DNA-DNA.
Z materiałów klinicznych najczęściej izoluje się gatunek A. baumannii, natomiast rzadziej inne gatunki: A.
lwoffii, A. johnsonii, A. junii, A. haemolyticus.
Acinetobacter  baumannii  charakteryzuje  wieloraka  oporność  na  antybiotyki.  Oporność  naturalna  na:
ampicylinę,  amoksycylina  z  kw.  Klawulanowym    Aktywne  mogą  być  nieliczne  leki,  m.in.  ampicylina  z
sulbaktamem,  ceftazydym,  imipenem  i  meropenem,  fluorochinolony  oraz  skojarzenia  ceftazydymu  i
cefotaksymu z aminoglikozydami lub fluorochinolonami.

Część praktyczna

Morfologia kolonii
Wzrost  wielu  drobnoustrojów  na  podłożach  stałych  jest  charakterystyczny  i  często  umożliwia  wstępną
identyfikację i ukierunkowanie dalszych badań, których celem jest określenie gatunku badanego szczepu.

Zwróć uwagę na wygląd kolonii i zapach hodowli i wpisz swoje obserwacje do tabeli.

Podłoże

Pseudomonas aeruginosa

Acinetobacter spp.

Agarowe

(zapach

hodowli,

wytwarzanie barwnika)

Agarowe z krwią (hemoliza)

Mac Conkey’a (wzrost na podłożu
i fermentacja laktozy)

cetrymidem

(piocyjanina,

fluoresceina – lampa UV)

Test utlenianie-fermentacja glukozy (OF-oxidation-fermentation)
Do różnicowania drobnoustrojów wykorzystuje się ich wybrane cechy metaboliczne. W identyfikacji wielu z
nich, także i pałeczek Gram-ujemnych, określa się zdolność do fermentacji glukozy. W teście tym
odróżniamy pałeczki Gram(-) fermentujące glukozę od pałeczek Gram(-) niefermentujących glukozy w
podłożu Hugh – Leifsona z błękitem bromotymolowym jako wskaźnikiem barwnym.
Odczytaj wynik badania i wpisz do tabeli

Podłoże

pokryte parafiną bez parafiny

Interpretacja

Pseudomonas aeruginosa

Acinetobacter spp.

„+” zmiana barwy z niebieskiej na żółtą

„-„ brak zmiany barwy

Test na wytwarzanie oksydazy
Odczytaj wynik badania i wpisz do tabeli

Pseudomonas aeruginosa

Acinetobacter spp.

Wynik

„+” intensywnie niebiesko-fioletowe zabarwienie
„-„ brak intensywnie niebiesko-fioletowego zabarwienia

Wzrost w bulionie
Wykorzystując zdobytą już wiedzę o typach wzrostu i wpływie temperatury na wzrost drobnoustrojów w
podłożu płynnym uzupełnij tabelę. Zwróć uwagę na wytwarzanie barwnika!

Bulion inkubowany w 37

Bulion inkubowany w 42

Pseudomonas aeruginosa

Acinetobacter spp.

Redukcja azotanów
Odczytaj wynik badania i wpisz do tabeli

/NO

Interpretacja

Pseudomonas aeruginosa

Acinetobacter spp.

/NO

– czerwone zabarwienie po dodaniu odczynników – „+”

– brak zabarwienia po dodaniu odczynników i cynku – „+”

„-„brak zabarwienia po dodaniu odczynników i czerwone zabarwienie po dodaniu cynku

Redukcja TTC na podłożu stałym
Odczytaj wynik badania i wpisz do tabeli

Pseudomonas aeruginosa

Acinetobacter spp.

Wynik

„+” czerwone zabarwienie kolonii na podłożu stałym
„-„ brak czerwonego zabarwienia

Wykrywanie ruchu w półpłynnym podłożu
Odczytaj wynik badania i wpisz do tabeli

Pseudomonas aeruginosa

Acinetobacter spp.

Wynik

„+” wzrost w podłożu i czerwone wybarwienie
„-„ wzrost tylko wzdłuż linii wkłucia

II. Diagnostyka bakterii beztlenowych

Bakterie beztlenowe można podzielić na przetrwalnikujące i nieprzetrwalnikujące.

Bakterie beztlenowe nieprzetrwalnikujące należą do różnych rodzajów bakterii Gram-ujemnych i

Gram-dodatnich.
Pałeczki  Gram-ujemne:  Grupa  Bacteroides  fragilis,  Grupa  Bacteroides  ureolyticus,  Wolinella,
Fusobacterium,  Porphyromonas,  Prevotella,  Mobiluncus,  Megamonas,  Selenomonas,  Leptotrichia,
Anaerospirillum
Pałeczki  Gram-dodatnie:  Propionibacterium,  Eubacterium,  Bifidobacterium,  Actinomyces,  Lactobacillus
Ziarniaki Gram-ujemne:Veillonella
Ziarniaki Gram-dodatnie: Peptostreptococcus.
Bakterie  beztlenowe  nieprzetrwalnikujące  stanowią  florę  fizjologiczną,  kolonizują  jamę  ustną,  przewód
pokarmowy, pochwę, skórę. W jelicie grubym i kieszonce dziąsłowej występują w stosunku 1000:1.
Zakażenia przez nie wywoływane maja często etiologię mieszaną i dochodzi do nich po przerwaniu ciągłości
tkanek,  w  miejscu  fizjologicznego  występowania  beztlenowców:  operacje,  ekstrakcja  zęba,  cukrzyca,
owrzodzenia,  nowotwory.  Uraz  zmniejsza  ukrwienie  i  obniża  stężenie  tlenu,  co  w  efekcie  powoduje
martwicę  niedokrwienną,  namnażanie  względnych  beztlenowców,  następnie  ścisłych  beztlenowców,  to
wywołuje stan zapalny, napływ granulocytów i ropień.
Peptostreptococcus:



fizjologiczne występowanie: jama ustna, jelita, pochwa



zakażenia: okołozębowe, jamy brzusznej, narządu rodnego, rany kąsane, w 80-90% zakażenia
mieszane

Veillonella:



fizjologiczne występowanie: jama ustna, pochwa



zakażenia: okołozębowe, głowy, szyi, narządu rodnego, zakażenia mieszane

Propionibacterium:P. acnes, P.granulosum, P. avidum



fizjologiczne występowanie: głębsze warstwy skóry, gruczoły potowe, gruczoły łojowe



wytwarza kwas octowy i propionowy, histaminę i tryptaminę, są oporne na wewnątrzkomórkowe

niszczenie przez granulocyty



zakażenia: nasilają zmiany trądzikowe, rzadko zakażenia oportunistyczne protez, oka, kości,
bakteriemia

Actinomyces: A. israelli, A.viscosus, A. naeslundii, A. odontolyticus



fizjologiczne występowanie: płytka nazębna (współudział w próchnicy), pochwa



zakażenia: promienica twarzowo-szyjna (po ekstrakcji zęba, urazach), promienica klatki piersiowej,
promienica brzuszna, zakażenia wewnątrzmaciczne (wkładki mechaniczne). Charakterystyczna
wydzielina krwisto-ropna z „ziarnami siarki”

Bifidobacterium



fizjologiczne występowanie: jama ustna, przewód pokarmowy, pochwa



wytwarza witaminy B

, B

, K, uwalnia kwas mlekowy, który ułatwia wchłanianie wapnia; gatunki

stanowiące naturalną mikroflorę pochwy, rozkładają glikogen ze złuszczonego nabłonka pochwy,
wytwarzając kwas mlekowy i kwas octowy – zapewnia to kwasowość środowiska pochwy i chroni
przed wtargnięciem chorobotwórczej flory bakteryjnej



zakażenia: oportunistyczne, mieszane infekcje dolnych dróg oddechowych

Eubacterium



fizjologiczne występowanie: nosogardziel, kieszonki dziąsłowe, płytka nazębna, jelito grube,
pochwa



zakażenia: oportunistyczne, zapalenia ozębnej

Lactobacillus



fizjologiczne występowanie: jama ustna, przewód pokarmowy (zwłaszcza u niemowląt karmionych
piersią),  pochwa  (rola  ochronna  w  zapobieganiu  kolonizacji  i  rozmnażaniu  się  drobnoustrojów
chorobotwórczych, co wynika z wytwarzania przez te pałeczki bakteriocyn, kwasów organicznych –
kwas  mlekowy  i  nadtlenku  wodoru;  ze  względu  na  te  właściwości  pałeczki  te  stosowane  są  jako
probiotyki w leczeniu i profilaktyce biegunek różnego pochodzenia oraz zakażeń pochwy. Pałeczki
zasiedlające  pochwę  nazywane  są  pałeczkami  Doederleina:  L.acidophilus,  L.casei  subsp.casei,
L.fermentum, L.cellobiosus)



zakażenia: oportunistyczne (u osób z dysfunkcją układu immunologicznego powstałą w wyniku
leczenia chorób nowotworowych za pomocą chemioterapii, radioterapii, stosowania immunosupresji
w zapobieganiu odrzucenia przeszczepu lub wynikająca z innych chorób: AIDS, cukrzyca) –

przeważnie posocznica, zapalenie wsierdzia, zapalenie płuc, ropnie narządów wewnętrznych;
udział w próchnicy zębów

Grupa Bacteroides fragilis



fizjologiczne występowanie: przewód pokarmowy, narządy moczowo-płciowe, jama ustna, gardło i
górne drogi oddechowe



zakażenia: oportunistyczne, endogenne, które przebiegają zwykle wytworzeniem ropnia; przewlekłe
zapalenie ucha środkowego, zapalenie zatok, ropnie płuc, zachłystowe zapalenie płuc, ropnie
wątroby, zapalenie dróg żółciowych, zapalenie wyrostka robaczkowego, zakażenie martwicze i
zgorzelinowe w obrębie jamy brzusznej, ropnie dróg rodnych, ostre zapalenie jajników i jajowodów,
ropnie okołoodbytnicze, pourazowe zapalenie kości i tkanek miękkich, zapalenie szpiku, bakteriemie

Porphyromonas



fizjologiczne występowanie: jama ustna



zakażenia: oportunistyczne; infekcje okołozębowe, zakażenia dróg moczowo-płciowych

Prevotella



fizjologiczne występowanie: jama ustna



zakażenia: infekcje ropne w obrębie głowy i szyi, zapalenie dziąseł, zapalenie gardła i migdałków,
zapalenie zatok, przewlekłe zapalenie ucha środkowego, zakażenie dolnych dróg oddechowych, dróg
moczowo-płciowych, bakteryjne zakażenie pochwy

Fusobacterium



fizjologiczne występowanie: jama ustna, na szyjkach zębów, w kieszonkach dziąsłowych, w drogach
oddechowych, w przewodzie pokarmowym, w układzie moczowo-płciowym



zmiany ropne i zgorzelinowe: ropnie płuc i zgorzel płuc, ropnie mózgu, zapalenie gardła i
migdałków, zapalenie opłucnej i otrzewnej, ropnie wątroby, zapalenie szpiku, zmiany martwicze,
owrzodzenia i rany pooperacyjne

Bakterie beztlenowe przetrwalnikujące obejmują rodzaj Clostridium.
Znanych jest ok. 100 gatunków tego rodzaju, z czego ponad 40 izolowano dotąd od ludzi. Niektóre z tych
gatunków  wchodzą  w  skład  flory  kolonizującej  błony  śluzowe  różnych  układów,  najczęściej  przewodu
pokarmowego. Często są spotykane w kale ludzi zdrowych.
Wszystkie  bakterie  z  rodzaju  Clostridium  to  Gram-dodatnie  laseczki,  wytwarzające  przetrwalniki.
Większość produkuje toksyny i enzymy toksyczne, odpowiedzialne za wywoływanie określonych zmian w
tkankach  (skurcz  mięśni,  zaburzenia  przewodnictwa  w  o.u.n.,  porażenia  spastyczne,  zmiany  martwicze  i
inne). Za toksykoinfekcje odpowiedzialne są głównie:

Clostridium perfringens – zgorzel gazowa

(w połączeniu z innymi gatunkami 2, 3 lub więcej, np. Clostridium septicum, Clostridium
novyi, Clostridium sporogenes lub Clostridium histolyticum, Clostridium bifermentans,
Clostridium sordelli lub innych)

-

Clostridium septicum - obrzęk złośliwy

(często w skojarzeniu z Clostridium butiricum, Clostridium baratii, Clostidium
haemolyticum)

-

Clostridium botulinum – zatrucie jadem kiełbasianym

Clostridium

difficile

– rzekomobłoniaste zapalenie jelita grubego po

antybiotykoterapii, zespół AAC

Clostridium tetani – tężec

Komórki wegetatywne z młodych hodowli barwią się Gram-dodatnio, natomiast ze starych Gram-ujemnie.
Wytwarzają przetrwalniki umieszczone w komórce centralnie, terminalnie lub subterminalnie, stąd
komórki przypominają wyglądem osełkę, rakietę tenisową, pałeczkę dobosza (laseczka tężca) lub maczugę
(można obserwować w preparatach barwionych metodą Schaeffera-Fultona).

Należą do drobnoustrojów beztlenowych dlatego muszą być hodowane w warunkach beztlenowych.

Podłoża do hodowli bakterii beztlenowych

płynne



bulion tioglikolanowy (bioMerieux - bulion tioglikolanowy z rezazuryną jako

wskaźnikiem stopnia natlenienia podłoża); tioglikolan sodu obniża potencjał oksydo-
redukcyjny podłoża



bulion Schaedlera do izolowania względnych i bezwzględnych beztlenowców; obecność
heminy, ekstraktu drożdżowego, witaminy K3 ułatwia rozwój bakterii o bardzo
wysokich wymaganiach wzrostowych

stałe



agar Columbia



agar Columbia + 5% krwinek baranich



agar Schaedlera



agar Schaedlera + 5% krwinek baranich



TSN Agar (Trypcase, Sulfite, Neomycin) (bioMerieux) – podłoże do izolacji

Clostridium perfringens

Systemy do hodowli drobnoustrojów beztlenowych

System,  który  składa  się  ze  szczelnej  koperty  z  przezroczystego  plastiku,  która
umożliwia  dzięki  generatorowi,  szybkie  uzyskanie  atmosfery  potrzebnej  do  hodowli
szczepów beztlenowych. Generator zawiera mieszaninę sproszkowanego żelaza, kwasu
cytrynowego  i  dwuwęglanu  sodu.  Po  dodaniu  wody  następuje  usunięcie  tlenu  i
wzbogacenie  atmosfery  w  CO

, co zapewnia szybki wzrost hodowli beztlenowej np.

Generbag anaer (bioMerieux), Anaerocult P, C mini, A mini (Merck)

system, który składa się z puszki (2.5 litrowy zbiornik ze stali nierdzewnej lub
przejrzystego plastiku), generatora umożliwiajacego uzyskanie warunków beztlenowych



Generbox anaer (bioMerieux) – generator w postaci koperty, która zawiera 3 tabletki z hydroboranem

sodu, dwuwęglanem sodu i kwasem cytrynowym, które mogą wytworzyć około 1,850 ml wodoru i 190
ml dwutlenku węgla. Koperta „beztlenowa” umożliwia otrzymanie warunków beztlenowych w
obecności czynnego katalizatora (aluminium opłaszczone 0.5% palladem). W kopercie znajduje się także
wskaźnik - pasek nasycony roztworem błękitu metylenowego, czynnika redukującego i stabilizatora.
Część reagująca, koloru niebieskiego, odbarwia się w warunkach beztlenowych (reakcja ta może trwać
kilka godzin)



Anaerocult A (Merck) – generator w postaci koperty umożliwiający po dodaniu wody bez katalizatora

uzyskanie warunków beztlenowych w przejrzystej plastikowej puszce mieszczącej 12 płytek Petriego.
Wskaźnik warunków beztlenowych – błękit metylenowy stosowany jest w postaci pasków (Anaerotest).

Bakterie z rodzaju Clostridium

nie wytwarzają katalazy

nie wytwarzają oksydazy cytochromowej

nie wytwarzają peroksydazy

Przy identyfikacji bakterii beztlenowych powinny być uwzględnione takie cechy jak:

test na tolerancję tlenu (przesiew na podłoże i hodowla w warunkach tlenowych)

morfologia kolonii

barwienie metodą Grama

ruch

testy biochemiczne

produkty metaboliczne (GLC)

wrażliwość na antybiotyki

testy serologiczne

Ostatnio  również  wprowadzono  sondę  genetyczną.  Do  identyfikacji  biochemicznej  dostępne  są  gotowe
zestawy  handlowe:  API  20  A  z  24  godzinną  inkubacją  w  warunkach  beztlenowych  i  Rapid  ID  32  A  w
ramach  systemu  ATB  Expression  (bioMerieux)  –  test  4  godzinny  nie  wymagający  inkubacji  beztlenowej
oraz kart do identyfikacji beztlenowców w systemie Vitek 2 compact.

Część praktyczna

Wpisz do tabeli swoje obserwacje

Szczep nr 1

Szczep nr 2

Szczep nr 3

Wzrost w podłożu płynnym
(zapach)

Wzrost na podłożu stałym
(zabarwienie wskaźnika!,
morfologia kolonii, zapach)

-  inkubacja beztlenowa

-  inkubacja tlenowa

Morfologia komórki w preparacie
barwionym metodą Grama

Przetrwalniki w preparacie
barwionym met. Schaeffera-Fultona

Wytwarzanie katalazy

Interpretacja