WYKŁAD 1 26.02.2007

1. Wstęp : omówienie przedmiotu wykładu, celu badań, ogólne metody mikrobiologicznej analizy żywności.

2. Metody ilościowego oznaczania drobnoustrojów.

Metody ilościowego oznaczania drobnoustrojów:

Bezpośrednie:

1. JTK, NPL - klasyczne oznaczanie ilości

2. Liczenie komórek w wyskalowanych objętościowo komorach

3. pomiar elektroniczny

4. DEFT

5. HGMF

6. Cystometria przepływowa

Pośrednie:

1. oznaczanie biomasy, białka, DNA oraz inny skł. Komórek , lub oznaczanie zawartości płynu pozakomórkowego

2. oznaczanie ATP

3. metody wykorzystujące pomiar parametrów elektrycznych

4. oznaczanie potencjału elektrycznego komórek

5. oznaczanie testem LAL

UWAGA - to co jest podkreślone to jest z wykładu z zeszłego roku!

Metody identyfikacji drobnoustrojów:

1. klasyczne

2. nowe:

- szeregi identyfikacyjne

- nowe podłoża i zestawy

- zestawy immunologiczne

1. testy ELISA

2. testy LATEKSOWE

3. immunomagnetyczna separacja

- metody oparte o budowę DNA i geny

-podłoża umożliwiające jednostopniową lub szybką identyfikację wybranych drobnoustrojów (wykorzystanie fluorescencji)

-identyfikacja genetyczna

1. sondy genetyczne

2. metody wykorzystujące PCR

Mikrobiologia prognostyczna (predykcyjna)

rolnictwo:

uprawa: mikrobiologia gleby, fitopatologia

hodowla: mikrobiologia weterynaryjna

przetwórstwo:

mikrobiologia żywności

przechowalnictwo:

mikrobiologia przemysłowa

konsumpcja:

higiena: mikrobiologia żywności

Niżej są podane patogeny które trzeba przynieść na egzamin własnoręcznie napisane. Do każdej rodziny trzeba dopisać po dwie podrodziny.

Najważniejsze patogenny związane z żywnością

Salmonella agona, enteritidis, paratyphi, typhi

Schigella boydii, dysenteriae, flexneri, sonnei

Escherichia coli (enteropatogenne) enteroinvasive strains, enteropathogenic strains, enterotoxigenic strains, O157:H7

Yersinia enterocolitica, pestis, pseudotuberculosis

Vibrio cholerae, parahaemolyticus, vulnificus,

Campylobacter jejuni, coli

Staphylococcus aureus, epidermidis, saprophiticus

Clostridium botulinum, perfringens, difficile, septicum, tetani

Brucella bovis, neotome, canis, suis, abortus, melitensis

Listeria monocytogenes,

Mycobacterium tuberculosis,

Bacillus cereus, species, coagulans, thuringiensis, subtilis

Grzyby:

Aspergilus flavus

Aspergillus parasiticus

Penicillium viridicatum

Fusarium

Phitomyces

Najważniejsze patogenny związane z żywnością:

Salmonella

Schigella

Escherichia coli (enteropatogenne)

Yersinia

Vibrio

Campylobacter

Staphylococcus aureus

Clostridium perfringens

Clostridium botulinum

Brucella

Listeria

Mycobacterium tuberculosis

Bacillus cereus

Grzyby:

Aspergilus flavus

Aspergillus parasiticus

Penicillium viridicatum

Fusarium

Phitomyces

.

Schemat badania ogólnego:

Badania mikroskopowe

Badania ilościowe

Badania jakościowe

Badania dodatkowe

Interpretacja wyników

Badania mikroskopowe:

1. wykazanie skażenia we florze produkcyjnej

2. wstępne oznaczenie ogólnej liczby drobnoustrojów

3. oznaczenie liczby drożdży

4. szybkie sprawdzenie proporcji drobnoustrojów przy procesach mieszanych

5. jako szybki test wstępny przy dojrzewaniu mleka o obecność bakterii z rodzaju Mycobacterium

6. w badaniach cytologicznych mleka

7. w badaniu wody na obecność pasożytów

Badania ilościowe:

1. oznaczenie ogólnej liczby bakterii

2. oznaczenie ogólnej liczby drożdży i pleśni

3. oznaczenie liczby drobnoustrojów z grup wskaźnikowych

4. oznaczenie liczby bakterii z grup fizjologicznych (proteolitycznych, amylolitycznych, lipolitycznych)

Badania jakościowe:

1. selektywne poszukiwanie patogenów (izolacja i identyfikacja)

2. izolacja i identyfikacja składników flory niepatogennej (korzystnej, pożądanej) lub patogennej (niekorzystnej, niepożądanej) w danym procesie konsumpcyjnym

Badania dodatkowe:

1. badania fizyko-chemiczne (np. test pasteryzacji)

2. badania organoleptyczne

3. inne

Grupy wskaźnikowe:

1. bakterie z grupy coli→ coliformy - Escherichia coli

2. Enterokoki kałowe→ enterokoki z grupy D - Enterococcus fecalis

3. Clostridia redukujące siarczyny - Clostridium perfringens

4. Gronkowce Staphylococcus aureus

5. Pleśnie i grzyby (bardzo lekkie, bardzo latwo Przenosza się przez powietrze, niepożądany ruch powietrza)

coliformy - bakterie z grupy coli typu kałowego - Escherichia, Citobacter, Enterobacter, Klebsiella (Seratia), są one zdolne do fermentacji laktozy z wydzieleniem gazu w 44ºC

enterokoki= dawne streptokoki z grupy D - Enterococcus fecalis, Enterococcus liquefaciens, Enterococcus faccium, Enterococcus durans, Enterococcus bovis, Enterococcus equinus

U zwierząt (w kale) jest więcej enerokoków niż coli ; w kale człowieka jest więcej coli!

Podłoża dla:

- coli: (ad1)

BCPL do oznaczania grup wskaźnikowych,

BLBVB - bulion laktozowy z żółcią i zielenią brylantową,

podłoże Schuberta,

Fluoroculty Brylla,

- streptokoki: (ad2)

podłoże Rotha,

podłoże Litzky'ego

- clostridium: (ad3)

podłoże Wilsona-Blaira,

agar TSC (tryptose sulfite cycloseine) (tryptoza, siarczyn, cykloseryna)?

- gronkowca: (ad4)

Giolitti-Cautoni (telluryn potasowy, telluryt sodu)

- pleśnie i drożdże: (ad5)

agar ziemniaczany

podłoże z antybiotykami

WYKŁAD 2 5.03.2007

Norma mikrobiologiczna musi definiować:

- minimalna ilość produktu, która ma być poddawana analizie

- maksymalną dopuszczalna ilość ogólnej liczby drobnoustrojów i/lub grup wskaźnikowych

- ilość produktu w którym NIE mogą występować patogenne drobnoustroje (Salmonella, Schigella) nieobecne w 25 mg, 25g podłoża, 100 ml wody

- metody analizy: aparatura, sposób rozdrobnienia, stosowane podłoża, temperatura, czas inkubacji, metodę identyfikacji…

Najważniejsze skróty dotyczące normalizacji:

ISO - Międzynarodowa organizacja Normalizacyjna

ICMSF - Międzynarodowa Komisja Mikrobiologicznej Standaryzacji Żywności

EN - Europejska Norma

PN - Polska Norma

BN - Branżowa Norma

ZN - Zakładowa Norma

PCBC - Polskie Centrum Badań i Certyfikacji

PCA - Polskie Centrum Akredytacji

CBJW - Centralne Biuro Jakości Wyrobów

IPMiT - Instytut Przemysłu Mięsnego i Tłuszczowego

PKN - Polski Komitet Normalizacyjny

AFNOR - Assosation francaise de Normalisation

DIN - Deutsches Institut fur Normung

BSI - Britisch Standards Institution

ANSI - American National standards Institute

CEN - Europejski Komitet Normalizacyjny

Centralne Biuro Jakości

Polskie Centrum Badań i Certyfikacji - 01.01.1994.

28.04.2000r zostało podzielone na PCBC i PCA

PCBC - certyfikuje

PCA - akredytuje

Akredytacja - to procedura, dzięki której autoryzowana jednostka formalnie uznaje, że jednostka lub osoba jest kompetentna w przeprowadzeniu określonych zadań.

Certyfikacja - to procedura, dzięki której strona trzecia (niezależna od odbiorcy i dostawcy) daje pisemne zaświadczenie, że dany wyrób, usługa itd. Jest zgodna z wyszczególnionymi wymaganiami.

Księga Jakości - ogólne procedury - zapewnienie jakości (formularze, instrukcje, procedury i instrukcje badawcze, instrukcje sprawdzenie wyposażenia).

Inne skróty:

CENELEC - Europejski Komitet Normalizacyjny Elektrotechniki,

EAC - Europejska Organizacja Jednostek Akredytujących i Jednostki Certyfikujące

EOQ - Europejska Organizacja Jakości

EUROLAB - Forum wymiany Doświadczeń

IQNet - Międzynarodowa sieć Certyfikująca w Systemie Jakości

EQNet - Międzynarodowa sieć Certyfikująca

EN 45001: 1989 pkt 5.4.2. System Jakości, Księga Jakości -

EAL - Europejska Organizacja Jednostek Akredytujących

POLLAB - polska gałąź EUROLAB

PCBC:

- organizuje i nadzoruje system badań i certyfikacji

- certyfikuje systemy jakości dostawców

- certyfikuje audytorów

- organizuje szkolenia i doskonalenia kadr na potrzeby badań i certyfikacji

PCA:

- akredytuje laboratoria badawcze

- akredytuje jednostki certyfikujące

- kontroluje działalność akredytowanych lub badawczych jednostek certyfikujących

- organizuje szkolenia i doskonalenia kadr na potrzeby badań i certyfikacji

Schemat ogólny:

10 g produktu + 90 ml soli fizjologicznej

Homogenizacja (Stomacker 400)

Seria dziesiętnych rozcieńczeń

Drobnoustroje tlenowe agar odżywczy 30C , 72h wszystkie

25C , 48h kolonie

Enterobacteriacea URBG 30C , 24-48h różnie

BLBVB

E. coli Fluorocult +MUG 35C, 24-48h fluorescencja, gaz i wytwarzanie indolu

Enterococcus m-enterococcus 37C , 48h czerwone i różowe kolonie

podloże Roth'a katalazo ujemne

Konieczne potwierdzenie

Micrococcus Agar KRANEP 37C, 48h Ziarniaki katalazo dodatnie

Saphylococcus Chapmania Test na koagulazę

Clostridium DRCM agar, 37C , 72h czarne kolonie

podłoże wrzoska anaerobowo

Drożdże i pleśnie Agar ziemniaczany 25C , 3-5dni drożdże i pleśnie

z antybiotykiem

Ogólny klucz identyfikacji bakterii ważnych w dziedzinie żywności:

1. Ziarniaki G+

I.1.Katalazo-dodatnie - zgrupowane w grona: Staphylococcus, Micrococcus

I.2.Katalazo-ujemne - zgrupowane w łańcuszki: Streptococcus, Lactococcus, Leuconostoc, Pediococcus, Enterococcus;

2. Pałeczki i laseczki G+

II.1.Zarodnikujące:

II.1.1.Katalazo-dodatnie, tlenowce: Bacillus

II.1.2.Katalazo-ujemne, beztlenowce: Clostridium

II.2.Niezarodnikujące:

II.2.1.Katalazo- dodatnie: Corynebacterium, Propionibacterium, Brevibacterium, Streptomyces, Mycobacterium

II.2.2.Katalazo-ujemne: Lactobaclillus

3. Pałeczki i coccopałeczki G-

Oksydazo-dodatnie: Pseudomonas, Acetomonas, Gluconobacter, Vibrio, Brucella

Oksydazo-ujemne: rodzina Enterobacteriaceae (Shigella , Salmonella)

/test na obecnośc oksydazy cytochromowej/

Metody bezpośrednie oznaczania ilości drobnoustrojów:

- klasyczne oznaczanie ilości JTK i NPL

- liczenie komórek w wyskalowanych objętościowo komorach

- elektryczny pomiar ilości drobnoustrojów

- DEFT

- HGMF

- cytometria przepływowa

JTK - Jednostka Tworząca Kolonię (CFU)

NPL - Najbardziej Prawdopodobna Liczba (MPN)

JTK lub NPL /Cfu Or MPN/

Przygotowanie do badania:

- przygotowujemy co najmniej 4 rozcieńczenia w dwóch powtórzeniach (hodowla na agarze)

- liczymy trzy lub dwa rozcieńczenia

- liczba koloni 30-300

- wynik podajemy na 1g lub 1ml

NPL - oznaczenie w podłożach płynnych

- 3 lub 5 powtórzeń, kilka rozcieńczeń

- wynik odczytujemy z odpowiedniego klucza

Mikrobiologiczny Próbnik Powietrza MAS 100

Stosowany jest do gotowych płytek Pertiego i samodzielnie wykonanych. Wymusza się obieg powietrza. Różna kalibracja przepuszcza 1000l powietrza w ciągu 10min. Można opóźnić włączenie pompy np. o 1godz. Małe urządzenie.

WYKŁAD 3 11.03.2007

Firma 3M produkuje Petrifilmy Plates

- analiza produktu

- analiza środowiska

Tylko trzy etapy:

1. inokulacja

2. inkubacja

3. odczyt

Różne płytki dla odpowiednich drobnoustrojów:

- ogólna liczba drobnoustrojów

- Rapid Coliform

- High- Sensivity Coliform

- Escherichia coli & Coliform

- drożdże i pleśnie

- Coliform

- Enterobacteriaceae

Budowa płytki typu Petrifilm:

- górna warstwa: plastik (można po niej pisać)

taśma adhezyjna ze wskaźnikiem

żel rozpuszczalny na zimno (podobne do podłoża agarowego)

- dolna warstwa: składniki podłoża

taśma adhezyjna

plastik zgrzany do kratkowanej bibuły

Powierzchnia - 20cm²

Posiew na płytki:

• posiew wgłębny - 0,1 ml

• posiew powierzchniowy - 1 ml

Takie same ilości posiewa się na petryfilmach!

(posiewamy roztwór macierzysty lub rozcieńczony)

(podobno na zwykle płytki posiewa się 5 ml)

Trwałość takich Petrifilmów to 12 m-cy (Petrifilm rapid Coliform Count plate and enterobacteriaceae Count Plate) i 18 m-cy (dla 3M^TM Petrifilm^TM), są bardzo dokładne.

Pakowane po 50 sztuk, w zgrzewane, aluminiowe opakowanie. Po otwarciu można zamknąć opakowanie specjalnym suwakiem (nie trzeba od razu wykorzystać wszystkiego)

Przechowywanie:

• poniżej 8C

• zakleić taśmą otwarte opakowania

• wykorzystać po otwarciu w ciągu miesiąca

Sposób przygotowania posiewu na Petrifilm:

-Przygotowanie próbki

/Próbkę rozdrobnić w stomacherze ; w zależności od typu analizy doprowadzić próbę do pH 6,6-7,2 lub 6,5 - 7,2 (1N NaOH lub 1 N HCl)/

-Rozcieńczenie i inokulacja 1 ml lub 5 ml (High-Sensitivy Coliform)

-Rozprowadzenie próbki

/Służy do tego pieczątka z ograniczeniem, ponieważ próba jest naniesiona na środek (lekko docisnąć) … zostawiamy na 3, 4 minuty/

-Inkubacja

/Max 20 w jednym stosie (dla High-Sensitivy Coliform max 10)/

-Odczyt i analiza

Normalnie płytki Petriego układa się po 8 w jednym stosie!

Analiza środowiska:

• odcisk z 20 cm3 (o dodaniu 1 ml wody destylowanej lub soli fizjologicznej-sterylny roztwór - przeprowadza się to w celu aby składniki podłoża i roztworu się rozpuściły)

• można przeprowadzić wymaz /patyczkiem i rozcieńczony/

• próbka powietrza

Uwaga! Po zadaniu próbki na petryfilm trzeba odczekać 3-4 minuty do rozpuszczenie zelu

HYGICULT - (laboratorium w probówce - szpatułki pokryte obustronnie dwoma różnymi podłożami) szybki dokładny test stanu higienicznego.

Nakłada się go przez (metoda pobierania próbek):

1.bezpośredni kontakt-odcisk,

2. nałożenie płytki,

3. zanurzenie płytki.

Wyniki są szacunkowe, porównujemy je z kluczem.

Podłoża (typy):

- ogólna liczba bakterii (Hagicult - TPC)

- Enterobacteriaceae (Hagicult - E)

- glukoronidaza (Hagicult - E/B)

- drożdże i pleśnie (Hagicult - Y+F)

Licznik elektroniczny

Budowa:

Są dwie elektrody oddalone od siebie. Malutki otwór umożliwia przejście cząsteczek do 30*m /apertura/, gdy taka cząsteczka przejdzie z komory do komory wywołuje zmianę napięcia. Każda komórka przechodząc powoduje zmianę napięcia.

Ruch komórek wywołany jest próżnią.

Aparat ten nie nadaje się do grzybów strzępkowych (bo komórka się ciągnie zakłócając sygnał), nadaje się tylko do czystych kultur bakterii i drożdży. Licznik nie sprawdza się do rozdrobnionych próbek.

Aparat bada:

-ilość komórek

-ich wielkość

!!! nie nadaje się do analizy zawiesin i liczenie pleśni.

System sterowniczy:

Aparat wytwarzający próżnię →aparat pomiarowy → komputer →ekran →drukarka

Aparatu nie stosuje się do mikrobiologicznej analizy żywności.

Aparat jest dobry dla:

-czystych hodowli

-liczenie leukocytów itp.

Aparat nie nadaje się do:

-próbek z mięsa, roślin

-drożdży i pleśni.

Gotowe zestawy do Monitorowania Higieny:

- Higicult, cult-Dip - mniej dokładne

- Envirocheck Contect

- Płytki Rodac

- Pertifilm

- Readycult

DEFT - Direct Epifluorescent Filter Technique (EGZAMIN)

DEFT jest kombinacją metody filtracji membranowej (koncentracja mikroorganizmów) z mikroskopią fluorescencyjną (wizualizacje pojedynczych komórek wybarwionych fluorochromami). Metoda bardzo szybka, 30 min, zdecydowanie lepsza od metod wzrostowych.

Tu barwi się DNA lub RNA. Barwienie oranżem akrydyny, barwienie komórek na filtrze.

Uwagi do rysunku:

- oranż akrydyny to barwnik zasadowy - pomarańczowy

- oranż akrydyny + DNA = monommer barwnika /podwójna helisa/ - barwa zielona przy 525 nm

- oranż akrydyny z RNA = polimer barwnika /pojedyńcza helisa/ - barwa czerwona przy 650 nm

Aparat wykorzystuje fakt występowanie epifluorescencji - fluorescencji odbitej.

Metoda szczególnie przydatna przy analizie mleka lub innego roztworu badanego.

PRZYGOTOWANIE PRÓBKI DLA MLEKA: DEFT

1. 0,5 ml bakteriotrypsyna - enzym umożliwiający wnikniecie barwników do komórki /następuje lekkie uszkodzenie błony komorkowej/

2. 2 ml Triton X-100 /detergent/ (0,5%);

3. 2 ml mleka - wszystko mieszać;

4. Inkubacja 10 minut w łaźni wodnej o temp, 50 C;

5. filtracja- próbkę dajemy do wieży filtracyjnej w niej są membrany poliwęglanowe, przesączamy próbkę;

6. barwienie i przemycie membrany, tu dajemy oranżu akrydyny (2,5 ml)na membranę !!!nie do probówk;

7. 2,5 ml buforu pH=3

8. 2,5 ml izopropanolu - odbarwienie tego co zabarwiło się niepotrzebnie

9. liczenie drobnoustrojów - membrany umieszczamy pod mikroskopem epifluorescencyjnym i liczymy. Liczenie bakterii o pomarańczowej fluorescencji.

Liczba liczonych pól widzenia	Średnia liczba grupek 1 polu widzenia
15	0-10
10	11-15
6	26-50
3	51+75
2	76-100
Analizę powtarzamy	Powyżej 100

Współczynnik mikroskopu = powierzchnia membrany filtracyjnej (mm²)/ powierzchnia pola mikroskopu (mm²) x objętość próbki (ml).

Uciążliwe jest liczenie. Teraz liczenie odbywa się na komputerze.

Liczymy święcące pola pod mikroskopem. Wynik to ilość Komorek w ml lub w l lub w g.

Należy zaobserwować około 300 święcących pól i odnieść do oznaczenia.

Przy surowym mleku korelacja żywych komórek i komórek policzonych jest bardzo wysoka.

Przy mleku pasteryzowanym (termicznie utrwalonym) nieżywe komórki fałszują wynik!

Aparat do liczenie bakterii - obecnie stosowany - aparat COBRA

Zalety stosowania DEFT:

1. metoda szybka (30 min jedno oznaczenie)

2. czuła - pozwala oznaczyć nawet <1komórkę/ml

3. dokładna - korelacja z oznaczeniami wykonanymi innymi metodami

4. niski koszt oznaczenia 1 próbki

5. łatwa do wykonania - akceptowana przez personel

6. zautomatyzowana i skomputeryzowana wersja DEFT (Cobra 2024) jednoczesna obróbka 24 próbek.

Zastosowanie:

- oznaczenie liczby zanieczyszczających mikroorganizmów w piwie, wodzie, popłuczynach, mleku, oznaczenie pleśni

- poprawę zróżnicowania komórek żywych i martwych w filtrowanych próbkach browarniczych osiągnięto:

- stosując w procedurze z oranżu akrydyny dodatkowy barwnik - siarczyn berberysy

- stosując inne barwniki fluorescencyjne (błękit aniliny, pochodne tetrazoliowe)

Wada:

- nie odznaczymy martwych i żywych komórek

HGMF - hydrofobowa kratkowa membranowa filtracja

Metoda bardzo stara

Membrana posiada miejsc hydrofobowe, które układają się w linie a linie w kratki (1600 kratek).

Membrana jest wykładana na płytkę Petriego z odpowiednim podłożem.

(Płytka Petriego, membrana przez którą filtruje się produkt. Kratki tworzą się przez hydrofobowe właściwości membrany.)

Najbardziej prawdopodobna liczba jednostek tworzących wzrost

MPNGU =

N- liczba kratek w HGMP

x- pozytywne kratki (wzrost)

zasady liczenia:

1. pozytywne <200 - liczymy wszystkie

2. pozytywne w 50% liczymy 8 środkowych kolumn i mnożymy x5 (8x40x5=1600)

3. pozytywne - przewaga duża - liczymy negatywne

metoda ta wychodzi z użycia.

WYKŁAD 4 19.03.2007

Cytometria przepływowa (EGZAMIN)

- to metoda pomiaru pojedynczych komórek lub cząsteczek przepływających przez aparat w strumieniu cieczy.

FACS - rozszerzona metoda cystometrii przepływowej, w której oprócz pomiarów komórek są stosowane również urządzenia sortujące (Fluorescens Acivating Cell Sorting).

Metoda daje najwięcej możliwości.

Mierzone sygnały:

- rozproszenie świtała przez badana próbkę,

-intensywność fluorescencji składników komórek lub zastosowanych barwników,

-absorbancję światła przez próbkę.

Ma zastosowanie w piwowarstwie, służy do badań bezpośrednich a także badań interpretacji.

Cytometria przepływa oparta jest o trzy układy:

- hydrauliczny

- optyczny

- informatyczny

HISTORIA:

• Moldoran w 1934 r zlicza komórki przepływające w kapilarze i ma problemy z jednolitym przepływem.

• W 1953 r opracowano technikę „strumień w strumieniu” - jednostajne przepuszczenie komórek przez mikroskop

• Komentsky w 1960 r wykorzystuje absorbancje DNA. - wybarwienie kwasów nukleinowych.

Metodą cytometri możemy mierzyć 6 różnych cech.

Wybiórcze barwienie pozwala rozróżniać gatunki w próbie.

Niektóre parametry komórkowe mierzone przez cytometrię przepływową:

- strukturalne: bez barwienia: ziarnistość cytoplazmy

zawartość pigmentów (np. hemoglobiny)

fluorescencja białek (tryptofan)

z barwieniem: zawartość DNA i RNA

struktura chromatyny

zawartość białka tłuszczu

obecność antygenów (identyfikacja)

obecność ergosterolu - zliczanie komórek drożdży)

zawartość Ca²⁺

- funkcjonalne: bez barwienia: stany redox

z barwieniem: przepuszczalność błony komórkowej

aktywność enzymów

receptory

potencjał komórkowy i pH

synteza DNA

Barwniki do cytometrii przepływowej:

• 
  FDA - dwuoctan fluoresceiny - rozkładany do fluoresceiny - żywe komórki wykazują fluorescencję (do pomiaru białek)

• CFDA - dwuoctan karboksyfluoresceiny

• Izotiocjanian fluoresceiny - wybarwienie białka w komórce

• BCECF-AM-2,7-bis-karboksy-etylo-5,6-karboksyfluoresceino-acetoksymetylowy ester do badania białek

• Rhodamina 123 - błony mitochondrialnej i błony komórek prokariota (rozróżnia martwe i żywe komórki, potencjał błony mitochondrialnej)

Z błona mitochondrialna - tu nie koniecznie żywa komórka, ale zawsze całe jądro bądź mitochondria, dotyczy eukariontów!

Z błona komórek prokriotów - wiążę się tylko do naładowanych błon komórkowych żywych komórek (błona musi być cała/integralna bo inaczej nie ma ładunku) - tu pokazuje żywe komórki

• DiOC6 - zależy od potencjału komórki (pomiar potencjału międzybłonowego)

• Dihydrorhodamina 123 - ukazują zmiany metaboliczne

• Dichlorofluoresceina - ukazują zmiany metaboliczne

• 
  Rhodamina 110 - pomiar aktywności enzymów

• HOECHST 33342 - barwienie DNA, bogate w pary AT (wybiórczo barwi obszary AT w kwasach nukleinowych)

• Chemichrom B - wybarwianie kwasów nukleinowych

• Mitamicyna - barwi chromosomy

• Jodek propidyny - barwi DNA - tylko w komórkach martwych NAJTAŃSZY !!!

• Piomina Y - stosowana do barwienia DNA

• Dwuoctan Karboksyfluoresceiny, izocyjanian - rozkładane przez mikroorganizmy do fluoresceiny (możliwość pomiaru)

Stosuje się lampy pobudzające barwniki

Phycoerythrin (PE) długość fali 535±5nm (lamp); 488nm (Arsen laser)

Fluoresceuin isothiocynate (FILC) 480±10nm (lamp); 488nm (Arsen laser)

Metodą ta można dokładnie wyznaczyć żywe i martwe komórki, o różnym poziomie fluorescencji, widać to na wykresie w postaci szczytów.

Wybiorcze barwienie przeciwciałami - możemy gatunki rozróżnić,

Pozwala na zliczanie komórek żyjących, ale nie zdolnych do wzrostu na agarze.

Nie z każdym barwnikiem metoda daje takie same wyniki - trzeba zawsze dobrać najbardziej odpowiedni barwnik.

Cystometria przepływowa - możemy rozróżnić komórki martwe od żywych np.. przy użyciu rodaminy 123 - u prokariota barwniki te łączą się z integralna nieuszkodzoną błona bakteryjna.

Przyrząd pomiarowy, rejestrujący, interpretujący

Szybkość przepływu cieczy w kapilarze 10-20m/s (szybkość płynu reguluje strumień w strumieniu)

Możliwość liczenia od 10⁴-10⁶ komórek/min.

Zliczamy sygnał dla 10 000 obiektów. Bardzo duża liczba populacji.

Liczenie na płytkach i cystometria przepływową daje korelacje r=0,99

Etapy postępowania

1. zebranie komórek - próbkę trzeba odpowiednio przygotować rozdrobnić itp.

2. barwienie fluorescencyjne - znakowanie (np. rodamina, dwuoctan fluoresceiny)

3. automatyczne pobranie i transport (zawiesiny znakowanych komórek) do punktu analizy

4. odczyt i interpretacja

Może to być metoda bezpośrednia i metoda interpretacji - ale tylko z fluoresceiną przeciwciała.

Zalety:

- szybka - czas wykonania całego testu do 30min (znakowanie komórek +odczyt)

- dobra korelacja (r=0,93-0,99) z metoda płytkową w zakresie 10⁴-10⁷ j.t.k/Ml

Wady:

- wysoki koszt kapitałowy, drogie cytometry

- specjalistyczna obsługa

Zastosowanie:

- kontrola prawidłowości przebiegu procesów biotechnologicznych (fermentacyjnych) ocena liczby, kształtu, wielkości, żywotności komórek

- oznaczenie liczby drożdży, bakterii w różnych próbkach browarniczych

- barwienie immunofluorescencyjne umożliwia identyfikację i liczenie kilku gatunków drobnoustrojów w jednym środowisku (S. cerevisiae, Schigella pomne, Lactobacillus brevis, Pediococcus damnosus).

Metody pośrednie oznaczania liczby drobnoustrojów:

- oznaczanie biomasy, białka, ilości DNA oraz innych składników komórki lub oznaczenia zawartości płynu pohodowlanego (ubytek substratu, przyrost glukozy itp.)

- oznaczenie potencjału elektrycznego komórek

- oznaczenie testem LAL

- oznaczenie ilości ATP - ważny test higieniczny

Pomiar gęstości optycznej

Aparat do hodowli drobnoustrojów mierzy ilość drobnoustrojów, wzrost, interakcje między drobnoustrojami na zasadzie absorbancji - Mikrobiology Workstation Bioscreen C - można wykonać wiele oznaczeń na jednym podłożu.

W mikrobiologii chodzi o to aby jak najszybciej wykryć złą jakość żywności, dążymy do takich metod w których pozbędziemy się złej jakości.

WYKŁAD 5 26.03.2007

(dr Barszczewski-uzupełnieniem jego wykładów są prezentacje doktora w Power Poincie)

OZNACZANIE POTENCJAŁU ELEKTRYCZNEGO KOMÓREK

Można to przeprowadzać na:

1. BACTOMETR

2. BAC TRAC

3. MALTHUS

4. RABIT

Pomiar elektryczny

Pierwsze badania parametrów elektrycznych robione były przez Okera i Bluma w 1910r.

R - rezystancja (opór czynny) *

Z - impedancja (opór pozorny) *

G - konduktancja (przewodność czynna) S (simens)

C - pojemność elektryczna F (farad)

U - napięcie elektryczne V

I - natężenie A

V - potencjał elektryczny V

Q - ładunek elektryczny C (kulomb)

Układ pomiarowy

Jeżeli mamy dwie próbki zerową i badaną to napięcie mierzymy przez różnicę pomiędzy nimi.

Nie wszystkie parametry elektryczne nadają się do pomiaru wszystkich grup drobnoustrojów np. dla drożdży nie nadaje się parametr - potencjał elektryczny, a tylko można mierzyć pojemność elektryczną.

W zależności od tego jakie drobnoustroje nam rosną to czas detekcji będzie różny, wydłużony.

RABIT /SCHEMAT/ - zasada jego działania oparta jest na impedencji

Mediatory - stosowane w wykrywaniu mikroorganizmów w komórkach bioelektrycznych.

/ w zależności od ilości komórek i dodania mediatora to wzrost był różny i sygnał miał wyższą wartość/

Mediatorami mogą być:

- tiamina - Proteus bulgaris

- TMAO - trójaminoetylo tlenek - Alteromonas sp.

Stosowane mediatory:

Etosiarczan fenazyny: Pseudomonas aeruginosa

Lactobacillus plantarum

Żelazicyjanek potasu: Alcaligenes faecalis

Enterobacter aerogenes

Lactobacillus bulgaricus

Lactococcus lactis

Nocardia

Saccharomyces cerevisiae

Cladosporium resinae

Dichlorofenyloindofenol: Achromobacter album

Dzięki mediatorom możemy lepiej odczytać zmianę potencjału.

Cechy mediatora:

- szybko ulega reakcji redox

-stabilnośc

-nie uczestniczy w innych reakcjach

-nie zmienia się pod wpływem pH

-jest nietoksyczny

-może być immobilizowany

Podczas wzrostu drobnoustrojów ulegają zmianie własności elektryczne podłoża:

- obniża się całkowicie impedancja (oporność przepływu prądu zmiennego przez przewodzącą pożywkę);

- wzrasta konduktancja (przewodnictwo) i kapacytancja (pojemność elektryczna)

Zmiana konduktancji przebiega dokładnie identycznie jak wzrost bakterii.

Impedymetry Malthusa (Malthus instruments GB)

Bactometr (bio Merieux F)

Zastosowanie w browarnictwie:

• zastępują próbę termostatową (czas testu ulega skróceniu z ok 3tygodni do 2-4 dni)

• określenie skażenia drożdży zarodowych bakteriami

• oznaczenie ogólnej liczby bakterii, drożdży i pleśni, a przy wykorzystaniu wybiórczych podłoży np. ilości Enterobacteriaceae

Zalety:

1. Redukcja czasu wykrywania drobnoustrojów:

1 komórka Escherichia coli - 9 godzin

1 komórka drożdży - 18-20 godzin

2. Możliwość różnicowania grup fizjologicznych drobnoustrojów (wybiórczość pożywki)

3. Równocześnie można analizować wiele próbek (nawet do 100 w zależności od aparatu)

4. Oszczędność materiałów i automatyczna interpretacja wyników

Wady:

1. Wysokie koszty kapitałowe (drogie urządzenia) i eksploatacyjne

2. Pewne podłoża nie nadają się do analizy elektrometrycznej (zakłócenia jonowe)

Degradacja wielkocząsteczkowych składników pożywek poprzez przemianę materii mikroorganizmów.

2. powstanie produktów małocząsteczkowych

3.pobór małych, ruchliwych jonów

4.zmniejszenie się impedancji medium lub elektrodowej

5.proporcjonalność zmniejszenie się impedancji medium - wzrost mikroorganizmów

M - względna impedancja całej próbki /zmiany składu jonowego próbki/

E - względna impedancja elektrod /zmiana impedancji przy samej elektrodzie/

BAC TRAC 4100/4300

Możliwość badania:

- kosmetyki i produkty higieniczne

- produkty mleczne

- mięso, ryby, drób

- warzywa

- żywność mrożona

- wyroby cukiernicze

- napoje

- środki farmaceutyczne

Oznaczenie	Limit elektryczny	Czas trwania badania
				Bac Trac	Płytki (JTK)
TVC (ogólna liczba drobnoustrojów)	10 JTK/g, 1JTK/ml	>10^6 6-10h 10^4 10-15h 10^2 15-20h 1 20-24h	3 dni
Drożdże i pleśnie	10JTK/g, 1JTK/ml	Max 72h	3-10dni
Coliformy	10JTK/g, 1JTK/ml	<16h	1-2dni
Enterobacteriaceae	10JTK/g, 1JTK/ml	<16h	1-2dni
Salmonella	1 komórka w 25g (+hodowla namnaż)	30-40h z namnażaniem	4-5dni
Listeria	1 komórka w 25g (+hodowla namnaż)	66h z namnażaniem	5-7dni
Clostridia	10JTK/g, 1JTK/ml	48h (C. perfringens 24h)	3-6dni
Staphylococcus aureus	1JTK/g	48h	2-4dni
Bakterie skażające piwo	1JTK/ml	Max 72h	3-7dni

WYKLAD VI 2.04.2007

Proste metody

LAL - Lizat Amebocytów Limulus'a

W 1964r. opracowano test do wykrywania endotoksyn bakterii z rodzaju Vibrio. Aktualnie stosowany test został opracowany w 1976r. przez Sullivan'a i współpracowników.

Lizat amebocytów Limulusa jako odczynnik LAL daje dodatni test tzn. żeluje głównie w obecności lipopolisacharydów (LPS) oraz z :

- β-glukanem

- peptydoglikanami (w dużych stężeniach)

- syntetycznymi dekstrynami

- karagenem

- mamnanem i dekstranem

- kwasami lipotejchojowymi

- materiałami celulozowymi (np. w hemodializatorach)

- pirogenami (np. z cukru)

- z wirusowym RNA i innymi RNA

- endotoksynami bakterii G(-)

- dużymi ilościami bakterii G(+)

Odczynnik LAL to lizat amebocytów hemolitycznych

Limus (Atlantyk)

Tachyplu (Pacyfik)

Carcinoscorpius (Pacyfik)

Mechanizm doprowadzający do żelowania odczynnika LAL, przez LPS (Nakamura i wps. 1986)

Mechanizm doprowadzający do żelowania odczynnika LAL, przez β-glukan (Morita i wsp. 1981)

Czynnik C jest procteazą serynową aktywowaną LPS, jest to glikoproteina zbudowana z 2łańcuchów białkowych.

Czułość testu LAL - autorzy Sullivan i wsp.

Można ją zwiększyć przez:

- żelowanie w mikrokapilarach

- pomiar zmętnienia

- automatyczny pomiar zmętnienia z chromogenem znakowanym I¹²⁵

Test LAL jest stosowany:

- do badania płynów ustrojowych (mocz, krew, płyn mózgowo-rdzeniowy)

- na obecność pirogenów

- w diagnostyce infekcji oczu, dróg moczowych oraz innych zapaleń

- do badania żywności w szczególności żywności pochodzenia morskiego

- do badania wody pitnej

- do badania mleka surowego i pasteryzowanego

- przy poszukiwaniu pirogenów w cukrze

Czułość testu LAL zależy od:

1. przygotowania odczynnika

2. źródła LPS (od bakterii)

3. użytej metody (detekcja żelowania, warunki inkubacji)

Czułość testy LAL w przypadku różnych bakterii jest rożna. Minimalna ilość LPS 1 mg/ml.

0,07 mg polisacharydów/ml - zachodzi żelowanie.

Test HY - LITE - Bioluminescencja - pomiar ATP

ATP Mg²⁺ AMP+PP

Lucyferyna Lucyferaza Oksylucyferyna

O₂ CO²

Etapy postępowania:

- uwolnienie ATP z komórek do środowiska

- dodanie lucyferyny i lucyferazy

- pomiar emitowanego światła

Zaleta:

- pióro 2 w 1

- wykrywa niewidzialne resztki żywności

- łatwa obsługo

- czułość

- opatentowany system

ATP istnieje także we łzach, jest pochodzenia komórkowego ale nie musi występować tam gdzie są komórki.

Lucyferyna: C₁₁H₈N₂O₃S₂

Fotometr - najważniejszą częścia jest lustro wklęsłe które skupia światło wydzielane w czasie realizacji w jedno miejsce.

RLU - jednostka pomiarowa ATP

Stosunek ATP niemikrobiologicznego do ATP pochodzenia mikrobiologicznego

Produkt	ATP nie pochodzące z drobnoustrojów	ATP mikrobiologiczny
Mleko	15	1
Bekon	300	1
Rosół z makaronem	3500	1
Rozdrobnione mięso	12000	1
Lody	40000	1
Sok pomidorowy	∞	1

To jest test higieniczny - czystośći środowiska pracy, czystości maszyn, rąk, a nie jest testem ilości drobnoustrojów (bo niektóre produkty zawieraja bardzo dużo ATP, którego nie można odnieść do ilości drobnoustrojów)

Bioluminescencja - pomiar ATP

Zalety:

- czułość: ~1000komórek bakterii

~100 komórek drożdży

- krótki czas pomiaru ~1min

- prostota oznaczenia i interpretacji wyników

- oznaczenie możliwe do wykonania w warunkach produkcyjnych (małe rozmiary lumenometrów, gotowe zestawy odczynników- „pióra”)

- dostępność w handlu

Wady:

- nie różnicuje grup drobnoustrojów

- precyzyjne ilościowe oznaczenie drobnoustrojów możliwe tylko w przypadku czystej kultury

Zastosowanie w przemyśle spożywczym:

- monitorowanie stanu sanitarnego:

higiena stanowisk,

powierzchni urządzeń

ludzi zatrudnionych w produkcji

ocena skuteczności dezynfekcji i mycia urządzeń

- badanie skażenia piwa, wina, wody, soków.

WYKŁAD 6 16.04.2007

Metody szybkiego oznaczania ilości drobnoustrojów: (EGZAMIN)

• pomiar ATP

• pomiar zmętnienie

• pomiar parametrów elektrycznych

• impedancji

• kapacytancji

• konduktancji

• cytometria przepływowa

DEFT

Czas trwania badania

Limit detekcji

Cecha	Bactometr	Bac Trac	Malthus	RABIT
Liczba testów jednocześnie	512	240	1200	512
Zakres temp ºC	18-55	4-60	5-96	15-46
Liczba kombinacji temperaturowych	8	6	5	16
Ilość typów jednostek inokulacji	1	2	3	1
Objętość próbki ml	2	5-100	2-100	2-12
Swobodne nastawienie próbek	Nie	Tak	Tak	Tak
Próbki testowe: - wielokrotnego użytku - dostępne handlowo	Nie Tak	Tak Nie	Tak Tak	Tak Nie
Pomiar	Z lub C	Z lub C	G	Z
komputer	W zestawie	W zestawie	Brak w zestawie	W zestawie

Klasyczne metody identyfikacji

1. charakterystyka mikroskopowa:

-bakterie obserwujemy pod powiększeniem 100 a drożdże 40

-przeprowadzamy również barwienie Grama

-sprawdzamy kształt, ruch - obecność rzęsek

2. charakterystyka makroskopowa:

-oceniamy wzrost na płytce, na słupku żelatynowym

-oceniamy kształt, barwę, wielkość koloni-przy rutynowej pracy

3. charakterystyka biochemiczna i fizjologiczna

4. charakterystyka wegetatywnych struktur rozmnażania (dotyczy głównie pleśni)

5. charakterystyka immunologiczna (badanie obecności antygenów na powierzchni komórki)

6. charakterystyka lizotypowa (możliwość wykazania lizy komórki pod wpływem wirusa atakującego komórkę - stosowanie bakteriofagów do identyfikacji drobnoustroju)

7. zdolności patogenne

C. Charakterystyka biochemiczna i fizjologiczna

C.1. badanie typu energetycznego i oddechowego:

-jeśli akceptorem wodoru i elektronów jest jakiś produkt pośredni - metabolizm fermentacyjny;

-jeśli akceptorem wodoru jest tlen - aerobizm bezwzględny;

-jeśli akceptorem wodoru są azotany, węglowodany, siarczany - anaerobizm bezwzględny;

C.2. badanie metabolizmu cukrowego (badanie utylizacji alkoholi cukrowych):

-sprawdzanie obecności β-galaktozydazy i inwertazy

-sprawdzanie czy drobnoustrój wykorzystuje monocukry, dwucukry czy wielocukry;

C.3. badanie metabolizmu białkowego

C.4. badanie metabolizmu tłuszczowego (wykorzystanie źródeł azotu i tłuszczu jako źródło węgla):

-stosuje się barwnik błękit Viktorii, który rozpuszcza się w tłuszczu - jeżeli drobnoustrój wykorzystuje tłuszcz to barwnik się wytrąca;

- dodatek tłuszczu do podłoża i obserwowanie wzrostu drobnoustrojów;

C.5. badanie ogólnych własności fizjologicznych:

-halofilność do 15%NaCl

-osmofilność do 70% dodatku cukrowego

-określenie zapotrzebowania czynników wzrostowych (zapotrzebowanie na witaminy)

-wrażliwość na antybiotyki\

-optymalna temperatura wzrostu i krytyczna temperatura wzrostu

-wytwarzanie barwników

-pH

C.1. Badanie typu energetycznego i oddechowego

Produkcja NH₃ i H₂S wykazywana jest także przy metabolizmie białkowym (nie wiąże się z anaerobizmem)

TYPY METABOLIZMU

1.Metabolizm cukrów

Wykonuje się test na wykorzystanie wielocukrów. Te źródła węgla są aplikowane na podłoże za pomocą testów cuksenograficznych.

1. Hodowla na podłożu Clark - Lubs'a

- test z czerwienią metylową RM (produkty kwaśne - końcowe produkty metabolizmu)

- test Voges - Proskamer'a VP (produkcja acetonu, detekcja acetonu)

2. krążki ONPG (orto-nitro-fenylogalaktozyd)

3. asymilacja kwasu cytrynowego - podłoże Simmons'a (dla Enterobacteriaceae / Enterobacterium)

2.Metabolizm białek

1. wykorzystanie makrocząsteczek

2. wykorzystanie poszczególnych aminokwasów

AD. I. ⇒ wykorzystanie makrocząsteczek (białko jako źródło C i N)

Wykorzystanie kazeiny:

• sprawdzanie wzrostu na podłożu z mlekiem - jeśli występują rozjaśnienia wokół kolonii, to znaczy że dany drobnoustrój wykorzystuje kazeinę;

• kazeina w pożywce powoduje zmętnienie - jeśli drobnoustrój ja wykorzystuje to zmętnienie zanika;

Wykorzystanie żelatyny - (upłynnienie podłoża żelatynowego)/wykorzystanie makrocząsteczek,

• pył węglowy jest zamknięty w żelatynie - podłoże bezbarwne. Jeśli żelatyna zostanie strawiona - pyl węglowy się uwalnia i podłoże przybiera czarna barwę.

AD.II.⇒wykrywanie obecności enzymów białkowych (WAŻNE NA EGZAMIN)

Metoda Kohn'a

- ODC - dekarboksylaza ornityny (do putrescyny)

- LDC - dekarboksylaza lizyny (do kadaweryny)

- ADM - dekarboksylaza argininy (arginaza)

- TDA - dezaminaza tryptofanowa

- PDA - dezaminaza fenyloalaniny do kwasu fenylopirogronowego

AD.III.⇒z metabolizmem białkowym wiąże się zdolność do wytwarzania indolu, H₂S, NH₃ (jako efekt dezaminacji aminokwasów)

- wytwarzanie indolu - na podłożu z peptonem + odczynnik Kovacs'a lub odczynnik Erlich'a

Służy do identyfikacji Escherichia Coli

- wytwarzanie H₂S - na podłożu Mossel'a, Kligler'a lub TSI

H₂S - powstaje z rozkładu cysteiny i metioniny

- wytwarzanie NH₃- na podłożu z peptonem + odczynnik Nessler'a

- wytwarzanie ureazy - na podłożu Ferguson'a, Stuart'a, Christensen'a

UWAGA! Na egzamin wystarczy jeden przykład do każdego myślnika (jedno podłoża)

WYKŁAD 7 23.04.2007

Ogólny klucz identyfikacji bakterii ważnych w dziedzinie żywności patrz wykład na początku.

(TEGO NIE MA NA EGZAMINIE)

Ogólny klucz identyfikacji bakterii należących do rodziny Enterobacteriaceae:

1. Laktoza+ (fermentacja) = bakterie z grupy coli, coliformy

1. cytrynian - brak wykorzystania = Escherichia coli

2. cytrynian + wykorzystanie

- RM⁺VP^- : indol - Citrobacter Freundi

indol+ Citrobacter intermedius

-RM⁺VP^- : ruchliwe LDC+ Enterobacter aerogenes

LDC - Enterobacter cloaceae

nieruchliwe Klebsiella

2. Laktoza - (brak fermentacji)

1. ureaza + (rozkład mocznika)

- fermentacja glukozy z gazem, β-galaktoza^- Proteus

- fermentacja glukozy bez gazu, β-galaktoza⁺ Yersinia enterocolitica

b) ureaza - (brak rozkładu mocznika)

- ruchliwe: indol+ H₂S - Providencia

H₂S + Edwardsiella tarda

indol - Żelatyna - Salmonella (RM⁺VP^-)

Hafnia alvei (RM^-, VP⁺)

Serratia (RM^-VP⁺, barwna)

Żelatyna +, RM^-VP⁺ Arizona (β-galaktoza+)

Salmonella (β-galaktoza-)

- nieruchliwe: LDC - Shigella

LDC+ Salmonella Galinarum

Badania biochemiczne i fizjologiczne:

- zapotrzebowanie na witaminy i czynniki wzrostu

- zdolność do wzrostu w obecności NaCl

- obserwacje mikroskopowe - zdolność ruchowa, kształt

- zdolność wytwarzania barwników

- badanie halofilnośći

- osmofilność - względem cukrów (glukozy, sacharozy) do ostatecznego stężenia 70% glukozy

- optymalna temperatura wzrostu + limit temperaturowy (temp max i temp min)

- zdolność do zarodnikowania - bada się przez pasteryzację

- oporność na antybiotyki i inhibitory

Charakterystyka płciowa struktur rozmnażania:

- nie jest to cecha dobra do identyfikacji drobnoustrojów (wyjątek grzyby strzępkowe)

- kolejne stadia rozwojowe drożdży i pleśni umożliwiają ich identyfikacje

- najpierw obserwujemy strukturę grzybni

- Zygomycetales - sprężniaki, cąłe ciało jedna komórka

- grzybnia stepowana - workowce, podstawczaki Ascomycetales - Bazydiomycetales

- pseudogrzybnia - charakterystyczna dla grzybów, pojedyncze komórki połączone ze sobą, drożdże

- fermentacja strzępki zdolność do wytwarzania artrospor Cladosporium - rodzaj Geotrichum

- tworzenie zarodników bezpośrednio na grzybni

- tworzenie zarodnika w strukturze strzępki (plechy)

- worki z zarodnikami

- wytwarzanie zarodników na komórkach zarodnionośnych (fialidy- wytwarzają zarodniki)

- plerotecium - rodzaj Phaetomium

- połączenie różnoimiennych strzępek - powstawanie owocników

Drożdże różnicuje się bardziej cechami fizjologicznymi niż morfologicznymi.

Różnicowanie drożdży na podstawie ich kształtu a nie sposobu rozmnażania.

Yarrowia lipolytica - wytwarza grzybni właściwą.

Uproszczony klucz do oznaczania drożdży występujący w produktach żywnościowych:

1. Rozmnażanie w podłożu płynnym przez podział komórki Mycelium i artrospory na agarze: Schizosaccharomyces

2. Rozmnażanie w podłożu płynnym przez pączkowanie Mycelium i artrospory na agarze: Endomycopsis (zarodnikujące askospory), Trichosporon (nie zarodnikuje)

3. Rozmnażanie przez pączkowanie biegunowe (bipolarne): Nadsonia, Hanseniospora, Kloeckera.

4. Rozmnażanie przez pączkowanie na całej powierzchni komórki (multipolarne):

Tu musimy sprawdzić zdolność do wytwarzania balistospor:

4.1. obecność balistospor: Sporobolomyces

4.2. brak balistospor + różowoczerwona barwa: Rhodotorula

4.3.brak balistospor + białe lub jasnokremowe

4.3.1 Zarodnikujące (podłoże Fowel'a)

4.3.1.1. metabolizm fermentacyjny, nie uwalniają askospor: Saccharomyces, zygosaccharomyces

4.3.1.2.metabolizm fermentacyjny, askospory łatwo uwalniane: Kluyveromyces

4.3.1.3.metabolizm oksydacyjny, wykorzystują azotany: Hansenula

4.3.1.4.metabolizm oksydacyjny, nie wykorzystują azotanów, komórki owalne, pseudomycelium: Pichia

4.3.1.5. metabolizm oksydacyjny, nie wykorzystują azotanów, komórki okrągłe, brak pseudomycelium: Debaryomyces

4.3.1.6.metabolizm oksydacyjny, hydrolizuja żelatynę: Yarovia

4.3.2.Niezarodnikujące: Candida

Wykazywanie bakteriofagów w wodzie (charakterystyka lizotopowa):

1. pobranie próbki 50 ml

2. namnożenie potencjalnego faga (pożywka z E. coli) 6-12h, temp 37ºC

3. przygotowanie hodowli E. coli 6h, temp 37ºC (osobno na plytce)

4. przesączenie hodowli faga przez sączek zatrzymujący komórki (bakterie zatrzymamy, wirusy przejdą)

5. „skropienie” przesączem płytek z 6h hodowlą E. coli przez 12-24h 37ºC (zbadanie czy wirusy działają na E. coli)

6.wyniki

1. nieobecne bakteriofagi - jednolity wzrost E. coli

2. obecność bakteriofagów /”łysinki”/

3. płytki kontrolne - jednolity wzrost E. coli /czysta woda skropiona przesączem/

4. brak wzrostu /czysta płytka skropiona przesączem/

BADANIE ZDOLNOŚC PATOGENNYCH (WAŻNE NA EGZAMIN)

Właściwości patogenne bardzo często wynikają z obecności enzymów, mogą być określone przez:

1. wykrycie obecności enzymów np.

1. hemolizyny - rozkład krwinek czerwonych α, β, γ;

2. fosfatazy, esterazy - powodują rozkład ATP w komórce - metody biochemiczne w probówce;

3. DNA-zy - rozkład kwasów nukleinowych /obecność DNA-zy - badamy na agarze z DNA i po wzroście spryskujemy NaOH i sprawdzamy obecność łysinek/

4. koagulazy /obecność koagulazy - enzym wytwarzany przez gronkowca złocistego, jego aktywność prowadzi do żelowania krwi. W teście wykorzystujemy plazmę królika/

2. drugim elementem patogenności jest obecność toksyn (np.botulinowa).

Kiedyś badało się to testami biologicznymi:

- wypreparowane jelita świnki morskiej (podobnie jak myszy)

- test na myszach - wykorzystywany w przypadku obecności toksyny botulinowej. Bierzemy 4 myszy, każdej podajemy próbkę z patogenem, trzem dajemy surowicę. Jeśli jedna zdechnie to świadczy to o obecności toksyny.

Dziś obecność toksyn bada się metodami np. HPLC.

SZEREGI IDENTYFIKACYJNE

/zminiatyruzowane probóweczki/

• GALERIE, ZESTAWY, PASKI

• API 20E - Analityczny Profil Identyfikacyjny zawiera 20 testów

ATB - Automatyczny Test Bakteriologiczny

CIT - wykorzystanie cytrynianu

GEC - wykorzystanie żelatyny

ADH - dehydrataza karnityny

LDC, ODC, URE

• METODOLOGIA

1. Podłoże izolacyjne - otrzymanie czystej kultury

2. Zawieszenie w 5 ml (9ml) H2O wody destylowanej

3. Inokulacja API 20E

WYKLAD 8 14.05.2007

Schemat ogólny

10 g produktu + 90 ml soli fizjologicznej

Homogenizacja (Stomacher 400)

Seria dziesiętnych rozcieńczeń

Drobnoustroje ……	Agar odżywczy	30ºC, 72h 25ºC, 48h	Wszystkie kolonie
Enterobacteriaceae	VRBG BLBVB	30ºC, 24-48h	Różne
E. coli	Fluorocult + MUG	25ºC, 24-48h	Fluorescencja i wytwarzanie indolu
Enterococcus	m-enterococcus podłoże Roth'a	37ºC, 48h	Czerowne i różowe kolonie katalazo ujemne
Micrococcus Staphylococcus	Agar Chapmana KRANEP	37ºC, 48h	Ziarniaki katalazo dodatnie, test na koagulazę
Clostridium	DRCM Agar, podłoże Wrzoska	37ºC, 72h, anaerobowo	Czarne kolonie
Drożdże i pleśnie	Agar ziemniaczany z antybiotykiem	25ºC, 72h- 5dni	Drożdże i pleśnie

UWAGA ! NA EGZAMIN NAUCZYĆ SIĘ CO NAJMNIEJ JEDNEGO OZNACZANIA DROBNOUSTROJU.

IMMUNOLOGICZNA IDENTYFIKACJA DROBNOUSTROJÓW

Wstęp - wprowadzenie do immunologii - definicje:

Determinanty antygenowe drobnoustrojów

Typowanie serologiczne

Test ELISA

Aglutynacja lateksowa

Immunomagnetyczna separacja

HASŁA:

Przeciwciała - białka produkowane w organizmie kręgowców w odpowiedzi na antygen

Antygen - substancja materii ożywionej lub nieożywionej, która po wniknięciu do organizmu kręgowca powoduje odpowiedź immunologiczną

Antygen swoisty - powstają określone przeciwciała

2 cecha - zdolność do wywoływania reakcji immunologicznej

3 cecha - zdolność wiązania, określony antygen powoduje … określonych przeciwciał

Antygeny:

- H - rzęskowy

- O - somatyczny (E. coli: O 157:H7; L. monocytogenes 4b; V. cholerae cholerae 01)

- K - otoczkowy

Antygeny wywołują pełną bądź niepełną reakcję immunologiczną. Jeżeli wniknie do organizmu kręgowca wywoła u niego reakcje immunologiczną, swoistą aglutynację, odczyny skórne, wiązanie dopełniacza. Przeciwciała produkowane są przez kręgowce, służą jako odczynniki do identyfikacji ( serotypowania) bakterii.

Przeciwciała nie są produkowane przez bakterie. One wykorzystują bakterie bo te mają antygeny.

Reakcje immunologiczne

Serotypowanie bakterii

Określenie typu surowicy z jaką reaguje badany szczep.

Reakcje:

- precypituje - precypitacja

- aglutynuje - aglutynacja (tworzy zlepy)

Ab - przeciwciała

Ag - antygen

Reakcje precypitacji:

Reakcje aglutynacji:

- aglutynacja cząstek obojętnych (lateksowe cząstki, krwinki czerwone) przez kompleks Ag-Ab

- aglutynacja wielofunkcyjnego antygenu ( komórek bakteryjnych) przez kompleks Ag-Ab

Znakowanie przeciwciał:

Ag+Ab*→AgAb*

Ag*+Ab → Ag*Ab

Ag+Ab₁+Ab₂* → AgAb₁Ab₂*

Test ELISA E - enzyme L - linked I - immuno S - sorbent A - assay

specyficzne przeciwciała Ab zaabsorbowane na płytce

badanie antygenu Ag (badana próbka)

badanie specyficznego Ab znakowanego enzymem

dodanie substratu (rozkładający enzym).

Pomiar intensywności zabarwienia- im enzymu więcej tym barwa jest intensywniejsza

Zestaw do badania Salmonelli (wynik po 24 h)

Wiadomości z Internetu:

jest testem immunologicznym reakcję barwną enzymu sprzężonego z przeciwciałami do jakościowego i ilościowego oznaczania antygenów.

Test wykonuje się w studzienkach wykonanych z plastiku do umieszczonych na specjalnie do tego celu zaprojektowanej mikropłytce. W przykładowej procedurze tzw. 'kanapkowego' testu ELISA do studzienki dodaje się przeciwciał przeciwko specyficznemu antygenowi, które przyczepiają się do powierzchni tworzywa sztucznego. Następnie dodawane są kolejno: antygen, przeciwciało drugorzędowe przeciwko antygenowi z przyłączonym enzymem (np. alkaliczną fosfatazą lub peroksydazą chrzanową), oraz substrat dla enzymu. W reakcji enzymatycznej powstający produkt jest barwny, a jego stężenie może być oznaczone spektrofotometrycznie. Zawartość enzymu, a więc i ilość powstałego produktu jest proporcjonalna do ilości antygenu.

Istnieje wiele odmian testu ELISA.

Test Tecra Unique Salmonella - zasada taka sama jak przy teście Elisa. Umożliwia dość czystą pracę z próbką. Pozwala przez 15-20h zidentyfikować w próbce Salmonella.

Rys.

Jest 6 etapów- cały test trwa niecałą dobę max 21h

Zawsze jest robiona próba kontrolna.

Testy lateksowe - aglutynacja czastek lateksu pod wpływem antygenu - przeciwciała dostępne dla: Gronkowców, Streptococcus, Staphylococcus, drożdży.

WYKŁAD 9 21.05.2007

Metody immunologiczne:

- inhibicja przeciwciała

Przeciwciało musi być wyinkubowane przez antygen.

Serotypowanie bakterii:

- określenie typu surowicy z jaką reaguje badany szczep

-reakcja precypitacji

TEST GLISA

-dla najbardziej patogennego szczepu E.coli (O157:H7)

-jest to płytka z dwoma okienkami gdzie:

• Pierwsze okienko - kontrola

• Drugie okienko - tu przeprowadzamy reakcje poprzez napipetowanie części roztworu badanego

-odczyt

IMMUNOMAGNETYCZNA SEPARACJA

• Zakupujemy granulki o właściwościach ferromagnetycznych, które SA pokryte plastikiem do którego przyczepione są Ab - przeciwko dowolnemu Ag

• Granulki oplaszczone Ab wsypujemy do hodowli przez co do nich przyczepiają się komórki

• Do zewnętrznej ścianki probówki przykładamy magnes przez co obserwujemy przyklejanie się do niej komórek

• Resztę zawiesiny wylewamy

• Następnie wymywamy komórki pozostałem w probówce i wysiewamy je na płytki - wtedy powinny wyrosnąć w postaci kolonii

/Immunomagnetyczna separacja - pozwala wyizolować bakterie z podłoża, cząstki, granulki ferromagnetyczne z podłoża np. jak będą opłaszczone przeciwciałem Salmonella to wyłapią Salmonella. W zależności czym je opłaszczymy do tego będą stosowane./

Etapy otrzymywania przeciwciał monoklinalnych

1. immunizacja zwierzęcia

2. wyizolowanie komórek śledziony

3. przygotowanie komórek szpiczaka

4. fuzja komórek szpiczaka z komórkami śledziony

5. hodowla klonów mieszańcowych

6. selekcja klonów pozytywnych

7. otrzymanie masowych hodowli form mieszańcowych

8. zagęszczenie i oczyszczanie przeciwciał monoklinalnych

9. analiza przeciwciał i określenie ich specyficzności

METODY OPARTE O WŁAŚCIWOŚCI GENÓW: (WAŻNE NA EGZAMIN)

1. budowa DNA: zasady azotowe A, T, C, G

Dezoksyryboza

Fosforan

2. właściwości: komplementarność zasad

swoista sekwencja

wierne powielanie

3. znakowanie i/lub detekcja

METODY OPARTE O DNA i RNA:

- sondy DNA

- rybotypowanie (rRNA)

- PEGE (żelowa elektroforeza w polu pulsacyjnym - kariotypowanie /oznaczenie chromatyny/)

- PCR - (reakcja łańcuchowa polimerazy) (NA EGZAMIN ZNAĆ SKŁADOWE)

-RT - PCR - (reakcja łańcuchowa polimerazy w oparciu o odwrotną transkryptazę)

- RAPD - (losowo amplifikowany polimorficzny DNA)

- RFLP - (polimorfizm długości restrykcyjnych fragmentów)

- AFLP - (polimorfizm długości amplifikowanego fragmentu)

- ITS oraz ETS-RFLP - (polimorfizm długości restrykcyjnych fragmentów, odcinków transkrypcyjnych wewnętrznych lub zewnętrznych względem genów kodujących rRNA najczęściej 16s rRNA)

- cCPR - (kompetytywne PCR) - ilościowe oznaczenie

- NASBA - sekwencjonowanie oparte na amplifikacji DNA

- technika „MicroArray”

WYKŁAD 10 28.05.2007

BADANIE WEDŁUG GEN - PROBE

1. liza komórek drobnoustrojowych + odczynniki lizujący (lub sonifikacja)

• Otrzymamy w probówce rRNA

2. hybrydyzacja (znakowany kwasem RNM)

rRNA + komplementarny DNA - 60min 72ºC

• powstały hybrydy DNA-rRNA lub brak hybrydów

3. separacja

Hybrydy + hydroksyapatyt + wirowanie (adsorbancja hybrydów na powierzchni hydroksyapatytu)

4. odczyt odczynnika znakującego w osadzie hydroksyapatytu (około 2 godziny)

W zależności od tego czym znakujemy, potem odpowiednim przyrządem sprawdzamy wyniki.

Zestawy Gen-Probe:

Campylobacter - C. jejuni. C. coli

Haemophilus inluenzae

Enterococcus

Listeria monocytogenes

Staphylococcus aureus

Mycobacterium tuberculosis

METODY OPARTE O PCR:

-Multiplex PCR - kilkustarterowe PCR

-Real Time PCR

-RAPD

-AFLP

-RFLP - PCR (ITS - RELP dla genów rRNA)

-cPCR

-RT - PCR

-Technika “MicroArray”

1. POJEDYŃCZA I KILKUSTARTEROWA PCR (Multiplex PCR) JAKO METODA WYKRYWANIA I IDENTYFIKACJI DROBNOUSTROJÓW

• Pary primerów dobrane do sekwencji genów kodujących bakteryjne enzymy restrykcyjne

• pojedyncze powielanie DNA z bakterii

• jednoczesne powielanie DNA z różnych gatunków bakterii

badamy czy w jednej probówce nie ma kilu gatunków jednocześnie

Rozdział poszczególnych enzymów (dla różnych gatunków) w elektroforezie.

Czułość metody 10^-18 g (DNA) 1-10 komórek

10^-9 g (DNA) 100-1000 komórek

Metoda umożliwia wykrycie od 1 do 1000 komórek

2. cPCR - KOMPETYCYJNE PCR - ILOŚCIOWE OZNACZENIE BAKTERII

cPCR - ilościowe oznaczenie bakterii

Etapy opracowania metody:

1. porównano sekwencję genu 16S rRNA dla losowo wybranych 100 gatunków bakterii

2. wykonano wysoce konserwatywną sekwencję nukleotydów

3. skonstruowano dwa primery wiążące się dla tej sekwencji

4. skonstruowano hybrydowy starter umożliwiającego amplifikację kompetytora o długości 229 pz (par zasad) homologicznego do konserwatywnej sekwencji

5. otrzymano kompetytor

6. przeprowadzono kalibrację metody z użyciem kompetytora

Używamy tej metody do

-określania czystości jamy ustnej

-do określenia stanu czystośći wody miejskiej

Wiarygodność identyfikacji opartej o analizę genomu wynika:

1. z zasadniczej cechy budowy kwasów nukleinowych - komplementarność zasad azotowych

2. ze swoistości sekwencji nukleotydowej sondy lub starterów wybranych do analizy. Dobrana sekwencja może być swoista dla rodzaju, gatunku lub szczepu.

3. z możliwości identyfikacji powstałych produktów (znakowanie sondy lub rozdział elektroforetyczny produktów PCR i analiza obrazu)

WYKŁAD 11 4.06.2007

Etapy badań z wykorzystaniem PCR:

- zebranie materiału - wystarczy pojedyncza kolonia lub 2-10ml hodowli, 25mg próbki lub 25ml mleka.

- izolacja DNA - wieloetapowa, ale końcowa objętość próby na każdym z etapów nie przekracza 2ml

-PCR końcowa objętość mieszaniny reakcyjnej nie przekracza 100ul, w wielu przypadkach wystarczy 25ul.

-Elektroforeza - przyjazne aparaty, analiza obrazu przy pomocy komputera.

3. KILKUSTARTEROWE PCR - Multiplex PCR jako metoda identyfikacji grzybów patogennych

Zastosowano dwie kilkustarterowe PCR: G-T-P i F-A-N.

Wykorzystano pary starterów: starter wiodący i odwrotny - oskrzydlające fragmenty genów rRNA specyficzne dla następujących gatunków:

C. glabrata, C. tropicalis, C. parapsilesis, A. fumigatus, C. albicons, C. neoformans.

Odpowiednio: CGL1 i CGL2, CTR1 i CTR2, CPA1 i CPA2; oraz AFUM1 i AFUM2, CALBI1 i CALBI2, CN5 i CN4

PORÓWNANIE WYBRANYCH METOD

	RAPD	RFLP-CPR-rRNA	cCPR	Multipleks CPR
Matryca	+	+	+	+
Kompetytor	-	-	+	-
Primery	Jeden (2 funkcje)	Para	Para	Kilka par
Produkt	Różna ilość zależna od matrycy	Jeden	Dwa	Ilość zależna od homogeniczności matrycy
Analiza restrykcyjna	Nie stosowana	Konieczna	Zbędna	zbędna

Mikrobiologia prognostyczna

Przewidywanie przyszłych zdarzeń na bazie modeli matematycznych wykonanych na podstawie zebranych danych ze szczegółowych analiz mikrobiologicznych.

Wpływ: temp, pH, kwasów organicznych, NaCl, a_w, konserwantów i atmosfery gazowej na wzrost, śmierć i przyswajalność drobnoustrojów.

Modele matematyczne

np. modelowanie wpływu temp.

Model typu Arrheniusa

Lnk = lnA - E_a/RT

E_a - energia aktywacji T - temperatura w [K] R - stała gazowa

A - współczynnik kolizyjny

k - stala w szybkości i łańcuchu reakcji

Podstawowe równanie dla określenia wzajemnych związków

y = α + β_x1+ γ_x2 + ε

y - zmienna zależna

x1, x2 - zmienna niezależna

α, β, γ - parametry

ε - błąd lub składnik losowy

Reakcja łańcuchowa polimerazy, PCR (ang. Polymerase Chain Reaction) - łańcuchowa reakcja polimerazy, metoda powielania łańcuchów DNA w warunkach laboratoryjnych, polegająca na sekwencji wielokrotnego podgrzewania i oziębiania próbki. Technika wynaleziona w 1983 roku przez Kary'ego Mullisa i współpracowników z kalifornijskiej firmy Cetus. Za pracę w tej dziedzinie Kary Mullis otrzymał w roku 1993 Nagrodę Nobla.

Do reakcji wprowadza się matrycowy DNA, trifosforany deoksyrybonukleotydów, startery (primery), czyli krótkie (najczęściej ok. 20 nukleotydów) fragmenty DNA komplementarne do matrycy, oraz termostabilną polimerazę DNA (może nią być na przykład polimeraza Taq wyizolowana z bakterii Thermus aquaticus lub polimeraza Pfu z archeowców Pyrococcus furiosis. Polimeraza Pfu charakteryzuje się większą progresywnością niż Taq, jednakże działa wolniej. Dostępne są także inne polimerazy, będące z reguły modyfikacjami wyżej wymienionych). W wyższej temperaturze (zwykle około 95°C) pękają wiązania wodorowe i podwójna helisa DNA rozdziela się na dwa pojedyncze łańcuchy. W temperaturze niższej, ściśle określonej dla danej pary starterów (pomiędzy 45-70°C), przyłączają się one do matrycy. Podwyższenie temperatury do około 72°C powoduje utworzenie się na matrycy, z przyłączonymi do niej starterami, kompleksu z polimerazą DNA, wskutek czego rozpoczyna się synteza nici komplementarnej do matrycy.

Gdyby wydajność metody była stuprocentowa, po n cyklach reakcji z jednej cząsteczki można by uzyskać 2ⁿ cząsteczek. W praktyce wydajność jest mniejsza, co nie zmienia faktu, że metoda PCR znajduje wiele zastosowań, m.in. w klonowaniu genów, diagnostyce klinicznej, identyfikacji osób zaginionych, kryminalistyce, pracach nad gatunkami, które wyginęły.

Stosuje się również modyfikacje metody PCR m.in:

• RT-PCR (Reverse Transcription) modyfikacja polegająca na użyciu mRNA jako matrycy. Synteza DNA na matrycy mRNA odbywa się przy użyciu odwrotnej transkryptazy (RT). Następnie DNA namnaża się za pomocą zwykłej reakcji PCR. Metoda ta pozwala na amplifikację wyłącznie sekwencji zawartej w dojrzałym mRNA, a więc tylko egzonów. Powstały DNA określany jest jako cDNA - komplementarny DNA.

• - do środowiska reakcji wprowadzane są znakowane (np. barwnikami fluorescencyjnymi) nukleotydy bądź sondy łączące się z DNA, które pozwalają na podstawie odczytów w kolejnych cyklach określić ilość matrycy użytej do reakcji, jak również śledzić ilość powstającego produktu.

• nested-PCR - stosowany gdy dysponujemy niewielką ilością matryc DNA. Jego istotą jest synteza kilku długich fragmentów zawierających interesujący nas fragment na początku reakcji (dzięki czemu powielamy nasz materiał badawczy) a dopiero w następnym kroku dodajemy startery okalające nasz badany odcinek.

• PCR-RFLP

• RG-PCR

• ACRS-PCR

• ARMS-PCR

• ASA-PCR

• PCR-ASO

• PCR-HD

• PCR-SSCP

• PCR-DGGE

• PCR-TGGE

• inversed PCR

• PCR-OLA

• PCR-CCM

• PCR-PTT

• RAPD-PCR (Losowa Amplifikacja Polimorficznego DNA)- metoda polega na użyciu jednego, krótkiego, losowego startera. Łączenie starterów przeprowadzane w niskiej temperaturze- obniżenie specyficzności. Otrzymujemy różnej długości prążki będące cechą charakterystyczną danego osobnika (fingerprinting). Niestety przez niską temperaturę łączenia starterów (konieczne by uzyskać wystarczającą ilość produktów) metoda ma niską powtarzalność, i wynik zależy od wielu trudnych do określenia czynników (np. niewielkie wahania temperatury, użyte odczynniki, czasy nagrzewania/chłodzenia)

• REP-PCR

8

Człowiek

Zdrowie

Środowisko

Żywność

Nauka

PPRODUCENT

produkt końcowy

proces/produkt

produkt surowy

BADANIE MIKROBIOLOGICZNE

zła jakość

infekcja

zatrucie

KONSUMENT

kontrola rutynowa

kontrola w przypadku zatruć

ORGANA KONTRLOLI

Kontrola Jakości Badań

Porównanie międzylaboratoryjne

Kontrola wewnętrzna

Kontrola zewnętrzna

Udział badań porównawczych międzylabora-toryjnych

Kontrola planowana lub nie

Badania porównawcze między laboratoriami krajowymi

Badania próbek o znanych parametrach

Badania równoległe tej samej próbki przez dwóch analityków

Badania z zastosowanie dwóch metod badawczych

Badania wielokrotne tej samej próby przez jednego analityka

PODŁOŻE

Apertura

1 - 30 um

DUŻA KUWETA

MAŁA KUWETA

DNA

kompleks

Oranż akrydyny

RNA

Emisja światła

525nm

barwa zielona

650 nm

barwa czerwona

Monomer barwnika

Polimer barwnika

Wzbudzenie 450-490 nm

LPS

Czynnik C

Aktywny czynnik C

Czynnik B

Aktywny czynnik B

Proenzym żelujący

Enzym żelujący

Koagulogen

(żel) koagulin

β-glukan

Czynnik G

Aktywny czynnik G

Proenzym żelujący

Enzym żelujący

Koagulogen

Koagulin (żel)

Substrat

Metabolizm fermentacyjny

Produkt pośredni

NH₃ NO₃^-

H₂S SO

CH₄ CO₃^—

Bezwzględny anaerobizm

Bezwzględny aerobizm H₂O₂

Metabolizm oddechowy

H⁺

H₂O

NH₂

(CH₂)₄

NH₂

NH₂

(CH₂)₅

NH₂

NH₂-CH₂- CH₂- CH₂- CH₂- CH- NH₂

COOH

NH

C-N-CH₂- CH₂- CH₂- CH-COOH→ornityna+ CO₂+2NH₃

NH₂

NH₂

H

Antygen

Śledziona

Komórka śledziony

Hodowla komórek szpiczaka

1

2

4

3

5,6

7

Baza danych mikrobiologicznych

Modelowanie matematyczne

Baza modeli matematycznych

System ekspertów

Weryfikacja modeli

Centrum ekspertów

Przemysł

ważne

ważne

ważne

---