L A B O R A T O R I U M 5 / 2 0 0 9

|

. . .

W

L A B O R A T O R I U M

10

Nowe metody stosowane
w analizie żywności

– aspekt mikrobiologiczny

W

ciągu ostatniej dekady obser-
wowano wzrost infekcji wywo-
łanych spożyciem produktów

żywnościowych o niedostatecznej ja-
kości. Epidemiologia tych zatruć wciąż
ewoluuje nie tylko dlatego, że populacja
stała się wyjątkowo wrażliwa, ale przede
wszystkim z powodu zmiany stylu ży-
cia, tj. jemy coraz różnorodniej – żądni
przygód kulinarnych, poświęcamy mniej
czasu na przygotowanie posiłków, korzy-
stamy z wygodnej żywności. Rozwinęły
się również nowe zagrożenia, nowe grupy
patogenów związane z rozwojem tech-
nologii produkcji żywności, procesów
przetwarzania i dystrybucji.

METODY IDENTYFIKACJI
MIKROORGANIZMÓW

Do identyfikacji mikroorganizmów wy-
korzystujemy metody, które możemy
podzielić na 3 grupy:
– metody fenotypowe – wykorzystujące

cechy fenotypowe mikroorganizmów,
które można zaobserwować pod mi-
kroskopem. Na podstawie wyglądu
zewnętrznego nie można zidentyfi-
kować bakterii ze względu na podo-
bieństwo komórek między różnymi
filogenetycznie rodzinami,

– metody biochemiczne – metody stosowa-

ne głównie w przemyśle i wykorzystujące
produkty szlaków metabolicznych cha-
rakterystyczne dla danych drobnoustro-
jów. Na podstawie analizy metabolitów
bakteryjnych jesteśmy w stanie zaklasyfi-
kować je do danej grupy, a porównując
otrzymane wyniki z wynikami w bazach
danych, często możemy precyzyjnie
określić przynależność taksonomiczną
mikroorganizmów,

– metody genetyczne – najbardziej pre-

cyzyjne techniki wykorzystujące zdoby-
cze biologii molekularnej, opierające
się głównie na materiale genetycznym
drobnoustrojów, dzięki którym moż-

liwe jest bardzo dokładne określenie
przynależności gatunkowej bakterii,
a nawet określenie ich szczepu.

PRZYCZYNY ROZWOJU
SZYBKICH TECHNIK
IDENTYFIKACJI

Rozwój nowoczesnych technik z zakre-
su mikrobiologii, immunologii, biolo-
gii, biochemii i biofizyki przyczynił się
do postępu w zakresie szybkich metod
oznaczania i charakterystyki mikroorga-
nizmów w żywności. Nowoczesne meto-
dy mikrobiologiczne są ukierunkowane
przede wszystkim na szybkie i niezawodne
wykrywanie bakterii chorobotwórczych.
W zakresie szybkiego wykrywania i iden-
tyfikacji mikroorganizmów prym wiodą
nauki z zakresu medycyny. Postępujący
rozwój metod instrumentalnych i testów
diagnostycznych oraz postęp naukowy
wykorzystuje się do ulepszenia metod
izolacji, wczesnego wykrywania, liczenia,
charakterystyki i identyfikacji mikroor-
ganizmów. Monitorowanie produkcji
żywności poprzez system HACCP (Ha-
zard Analysis Critical Control Points) oraz
kontrolę higieny w ramach GHP (Good
Hygienic Practice), GMP (Good Manufactu-
ring Practice), MRA (Microbial Risk Asses-
sment), RM (Risk Management), RC (Risk
Communication) oraz TQM (Total Quality
Management) jest skutecznym, zgodnym
z obecnymi trendami sposobem zarządza-
nia jakością i bezpieczeństwem żywności.
Systemy te wymagają jednak nowocze-
snych, a przede wszystkim szybkich i jed-
noznacznych testów oceny m.in. stanu
mikrobiologicznego maszyn i urządzeń
produkcyjnych, surowca i produktu.
Dlatego w ostatnich latach obserwuje
się szybki transfer technik wykrywania
i identyfikacji drobnoustrojów z za-
kresu medycyny klinicznej do praktyki
przemysłowej. Adaptacja metod wymaga
jednakże opracowania właściwych proce-

STRESZCZENIE

Główne

niebezpieczeństwo dla zdrowia,

a nawet życia konsumenta związane

jest z pogorszeniem jakości zdrowotnej

produktu, co wynika z obecności

i rozwoju mikroorganizmów, przede

wszystkim chorobotwórczych. Dlatego

też jednoznaczna i szybka identyfi kacja

zagrożeń mikrobiologicznych w surowcu,

na wszystkich etapach procesu

technologicznego i w samym produkcie

jest konieczna. W artykule przedstawiono

zestawienie głównych nurtów i technik

mikrobiologicznych stosowanych obecnie

w praktyce laboratoryjnej i przemysłowej.

SŁOWA KLUCZOWE

metody

detekcji mikroorganizmów

SUMMARY

The main hazard

to consumer’s health, or even life,

is connected with the decrease of

product’s health quality which is the

fi rst of a number of consequences of

the presence and growth of pathogenic

microorganisms. Therefore unequivocal

and fast identifi cation of microbiological

risks in raw material, at all stages of

production process and in fi nished

product is necessary. In the paper

the review of the main trends and

microbiological techniques being used

at present in laboratory and industrial

practice has been presented.

KEY WORDS

methods of

microorganisms detection

dr inż. Kamila Goderska
dr inż. Artur Szwengiel

INSTYTUT TECHNOLOGII ŻYWNOŚCI POCHODZENIA ROŚLINNEGO
UNIWERSYTET PRZYRODNICZY W POZNANIU

. . .

W

L A B O R A T O R I U M

|

L A B O R A T O R I U M 5 / 2 0 0 9

11

dur analizy skomplikowanej matrycy, jaką
jest żywność, i dotyczy głównie sposobu
przygotowywania próbki.

Analiza mikrobiologiczna żywności

sprowadza się do oznaczenia ogólnej
liczby drobnoustrojów oraz stwierdzenia
obecności i poziomu patogenów. Licz-
bę drobnoustrojów oznacza się poprzez
posiewy płytkowe metodą wgłębną oraz
metodą powierzchniową. Tradycyjne
procedury są wieloetapowe, czasochłon-
ne, materiałochłonne, ponadto często
wymagają dużego doświadczenia perso-
nelu. Zaletami nowoczesnych technik
są przede wszystkim: oszczędność czasu,
możliwość oceny liczebności populacji,
identyfikacja gatunkowa oraz możliwość
zróżnicowania w obrębie gatunku.

Nowe narzędzia, jakie dają nam osią-

gnięcia naukowe w dziedzinie immuno-
logii, biologii molekularnej, biochemii,
biologii z elementami chemii, fizyki
i biofizyki, powinny być wykorzystywa-
ne w dwóch płaszczyznach w celu kom-
pleksowego zapewnienia bezpieczeństwa
zdrowotnego żywności. Z jednej strony
powinno się prowadzić badania monito-
ringowe obejmujące zakład produkcyjny.
Z drugiej strony szczegółowa wiedza o za-
chowaniu się mikroorganizmów w odpo-
wiedzi na określone warunki środowi-
ska pozwala na obiektywne określenie
wpływu procesu technologicznego oraz
warunków dystrybucji i magazynowania
na stopień skażenia mikrobiologicznego
i jego jakość; wiedzę tę, jak i procedu-
ry, powinny z kolei zakładom zapewnić
placówki naukowe.

CELE I ZAKRES
OCENY STANU
MIKROBIOLOGICZNEGO

Mikrobiologiczne badania monitoringowe
powinny zatem uwzględniać:
– mikrobiologiczną ocenę surowców,
– higienę zakładu (personelu, urządzeń

i pomieszczeń produkcyjnych),

– konfekcjonowanie, dystrybucję i trans-

port produktów oraz ich przechowy-
wanie.
Monitorowanie, w tym rutynowa

kontrola jakości i bezpieczeństwa surow-
ców oraz gotowych produktów, wymaga
posługiwania się odpowiednimi i specy-
ficznymi dla mikrobiologii wskaźnika-
mi. Wskaźniki mikrobiologiczne można
podzielić na:
– wskaźniki jakości produktu (oznacze-

nie typowych, pożądanych bądź też

nietypowych i niekorzystnych mikro-
organizmów oraz ich metabolitów,
które można szybko zidentyfikować
i oznaczyć),

– wskaźniki bezpiecznej żywności (wykry-

wanie niepożądanych i patogennych
mikroorganizmów w sposób szybki,
łatwy i pewny, np. E. coli, Enterobacter,
Klebsiella, Salmonella, Listeria monocy-
togenes, Staphylococcus aureus),

– wskaźniki matematycznego mode-

lowania wzrostu niepożądanych mi-
kroorganizmów w danym produkcie,
służące do przewidywania jakości mi-
krobiologicznej żywności (Predictive
Microbiology).

CHARAKTERYSTYKA
TECHNIK DETEKCJI

Największą uwagę skupia się obecnie
na szybkich metodach detekcji mikroor-
ganizmów i ich automatyzacji. Praktycz-
ne znaczenie mają testy biochemiczne
do identyfikacji mikroorganizmów. Naj-
bardziej znanymi testami biochemicznymi
są testy API. W zasadzie oparte są one
na prostych reakcjach chemicznych, któ-
re zachodzą w podłożach wzrostowych;
niekiedy zachodzi potrzeba dodania
do podłoża po inkubacji odpowiedniego
odczynnika. Do badań używa się także
mikrotitrera płytkowego, wykorzystujące-
go inokulację za pomocą wielopunktowej
pipety inokulacyjnej. W badaniach mi-
krobiologicznych stosowane są również
testy immunoenzymatyczne, które oparte
są na metodach ELISA. Służą one głównie
do szybkiego wykrywania drobnoustro-
jów patogennych, takich jak: Salmonella,
Listeria, Staphylococcus, E. coli 0157:H7.
Do identyfikacji pałeczek Salmonella
oraz gronkowców chorobotwórczych
stosowane są testy serologiczne, czyli te-
sty hemaglutacyjne oraz testy lateksowe.
Modyfikacją płytkowej metody oznacza-
nia liczby mikroorganizmów w produk-
tach jest Petrifilm, złożony z podwójnej
warstwy zawierającej podłoże wzrostowe
w postaci żelu rozpuszczalnego w zimnej
wodzie i tworzącego błonkę. Petrifilmy
służą do oznaczenia ogólnej liczby bak-
terii tlenowych, drożdży i pleśni oraz
E. coli. Inna metoda to zastosowanie
płytki pokrytej podłożami, w przypadku
której posiew przeprowadza się przez za-
nurzenie, pocieranie lub metodą kontak-
tową (dociskową). Wykorzystywany jest
także system płytki spiralnej, polegający
na rozprowadzeniu płynnej próbki na po-

reklama

ANALIZATOR

BAKTERII

MODEL

BACTRAC 4300

Cechy:

t

w pełni zautomatyzowany

pomiar

t

metoda

impedancyjna

z pomiarem parametrów

M i E

t

zastępuje

metodę

płytkową

t

redukuje

kilkakrotnie

czas

detekcji

mikroorganizmów

t

łatwa preparatyka dla analiz
ilościowych i jakościowych

t

redukuje

koszta

analizy i nakład pracy

t

wysoka wydajność

(do 64 stanowisk

pomiarowych

i powyżej, aż do 768)

t

upraszcza i kompletuje

dokumentację

analiz

Zastosowania:

t

screening

patogenów

t

całkowita liczba bakterii

t

testy

sterylności

t

detekcja

wzrostu

mikroorganizmów

t

testy

aktywności

t

kinetyka

wzrostu

t

testy

inhibitorów

t

analiza grzybów i pleśni

t

optymalizacja

składu

artykułów

spożywczych

t

badania

biofilmów

i wiele innych

Legislacja:
*DIN 10115/10120
+ §35 LMBG,
OeNORM,
GOSSTANDARD, AFNOR

zzzÝv|odqwÝso

inż. JÓZEF NITKA

44-172 Niewiesze k. Gliwic, ul. Pyskowicka 12

tel. [phone], fax [phone]

e-mail: [e-mail]

ANALIZATOR

L A B O R A T O R I U M 5 / 2 0 0 9

|

. . .

W

L A B O R A T O R I U M

12

wierzchni i tworzeniu spirali Archime-
desa poprzez osadzenie smugi zawiesiny
w strumieniu próby zmniejszającym się
od środka płytki do brzegów.

Metoda Droplette polega na zmie-

szaniu rozcieńczonej próby z upłynnio-
nym podłożem agarowym w stosunku
1:9. Następnie zaszczepione podłoże
nanosi się w postaci kropelki o objętości
0,1 ml na plastikowe płytki i po skoń-
czonym czasie inkubacji liczy się mi-
krokolonie. Kolejną metodą są pomiary
turbidymetryczne. Analizator Bioscreen
jest całkowicie zautomatyzowanym syste-
mem analizy. Złożony jest z inkubatora,
wytrząsarki i automatycznego urządzenia
do jakościowego i ilościowego wykrywa-
nia mikroorganizmów. Próby lub ich roz-
cieńczenia są zaszczepiane automatycznie
w płytkach mikrotitrera. Wzrost mikroor-
ganizmów monitoruje się przez pomiar
gęstości optycznej co 10 minut.

Mikroskopia fluorescencyjna DEFT

ma szczególne znaczenie w ocenie jakości
bakteriologicznej mleka i mięsa oraz przy
produkcji piwa. Technika ta obejmuje
filtrowanie próby wstępnie traktowanej
enzymem celem lepszej filtracji próby
i separacji optycznej bakterii od otacza-
jącego tła. Oranż akrydyny barwi osiadłe
bakterie, a żywe komórki świecą na po-
marańczowo lub żółto, natomiast martwe
– na zielono. Modyfikacją tej metody jest
membrane filter microcolony fluorescent me-
thod (MMCF), stosowana do oceny ilości
drożdży i pleśni w piwie. Unieruchomione
na filtrach mikroorganizmy hoduje się
na selektywnych podłożach agarowych,
umożliwiających tworzenie się mikrokolo-

ni, które następnie barwione są oranżem
akrydyny. Niebieskie mikrokolonie liczo-
ne są w mikroskopie fluorescencyjnym
lub za pomocą analizatora.

Kolejną metodą jest pomiar aktywności

metabolicznej oparty na testach redukta-
zowych, metodzie impedymetrycznej, mi-
krokalorymetrii, cytometrii przepływowej,
biosensorach i pomiarze ilości enzymów.
Testy reduktazowe bazują na obserwacjach
zmian zachodzących w pożywkach w wy-
niku aktywności metabolicznej mikroorga-
nizmów. Enzymy bakteryjne, takie jak np.
dehydrogenaza, przenoszą atom wodoru
z substratu na barwniki typu redox, powo-
dując zmianę ich zabarwienia. Aktywność
enzymu jest zależna od liczby mikroorga-
nizmów, a miernikiem ich ilości jest czas,
w którym zajdzie zmiana zabarwienia
stosowanego barwnika redox. Stosuje się
takie barwniki, jak: błękit metylenowy,
resazuryna i chlorek tetrazoliowy.

Metoda impedymetryczna jest pomia-

rem oporności, jaką stawia podłoże dla
prądu zmiennego. Wykorzystuje się w niej
najnowszy analizator mikrobiologiczny
BacTrac. Kompleksowe składniki pożywek
(sacharydy, białka, tłuszcze) są katabolizo-
wane do naładowanych produktów meta-
bolizmu, takich jak: aminokwasy, kwasy
organiczne i inne niskocząsteczkowe me-
tabolity. Rozwój mikroorganizmów pro-
wadzi do obniżenia całkowitej impedancji
podłoża. Miernikiem detekcji mikroor-
ganizmów jest czas detekcji, po którym
następuje mierzalna zmiana impedancji
środowiska. Do określenia profilu wzro-
stu drobnoustrojów skażających próby
wykorzystywane są pomiary dwóch para-

metrów impedancyjnych próbki: M-value
(impedancja podłoża) i E-value (impe-
dancja elektrod). Mierzalna impedancja
środowiska następuje, gdy liczba bakterii
osiąga poziom 10

6

komórek, a drożdży

i grzybów – po osiągnięciu poziomu ok.
10

4

komórek. Stosując tę technikę, można

określić całkowitą liczbę mikroorganizmów,
a po zastosowaniu pożywek selektywnych
również bakterii chorobotwórczych, droż-
dży i pleśni. Technika ta znajduje zasto-
sowanie w analizie mleka, soków, jarzyn,
produktów mlecznych i przypraw. Zna-
mionuje ją szybkie testowanie aktywności
szczepionek przed ich wprowadzeniem
do procesów fermentacyjnych.

Mikrokalorymetria oparta jest na zja-

wisku wydzielania się ciepła podczas
wzrostu mikroorganizmów. Minimalny
poziom tworzenia ciepła dają próby za-
wierające ok. 1000 bakterii/ml.

Cytometria przepływowa opiera się

na pomiarze fizycznych i niekiedy che-
micznych cech komórek, które są zawie-
szone w roztworze i pojedynczo przepły-
wają przez sensory optyczne. Komórki
poruszają się w płynie o szybkości prze-
pływu od 10 m/s do 20 m/s; po oświe-
tleniu ich światłem rejestruje się liczbę
i rozmiar cząsteczek. W tej metodzie
wykorzystuje się również znakowanie
składników komórkowych, takich jak:
białka, kwasy nukleinowe, lipidy czy
antygeny powierzchniowe, za pomocą
fluorochromów. Metodę tę stosuje się
do określenia ogólnej liczby drożdży i pa-
łeczek mlekowych, coraz częściej jednak
wykorzystywana jest też do wykrywania
poszczególnych grup mikroorganizmów.

M

ikroskopia

fluorescencyjna DEFT

ma szczególne znaczenie

m.in. w ocenie jakości

bakteriologicznej mleka.

fot

. Shutt

erst

ock

. . .

W

L A B O R A T O R I U M

|

L A B O R A T O R I U M 5 / 2 0 0 9

13

Biosensory dają sygnał w odpowiedzi
na zmiany środowiskowe, reagując np.
na ciepło, światło i pH. Sensorami są róż-
nego typu elektrody.

Bakterie z rodzaju Enterobacteriaceae

wytwarzają enzym ß-D-glukuronidazę.
Jest on produkowany przez E. coli i część
szczepów z rodzaju Shigella, Salmonella
i Arizona. Pozostałe bakterie z rodziny
Enterobacteriaceae nie wytwarzają tego
enzymu. MUG jest substratem, który
pozwala dość szybko wykryć aktywność
tego enzymu. Związek ten, w wyniku
hydrolizy przez enzym glukuronidazę,
ulega rozkładowi z wydzieleniem 4-me-
tyloumbeliferolu, wykazującego niebieską
fluorescencję w świetle UV.

Kolejną metodą jest pomiar metabo-

litów pośrednich lub produktów koń-
cowych. Oznacza się np. pirogronian.
W tym celu wykorzystuje się metodę enzy-
matycznej redukcji kwasu pirogronowego
przez dehydrogenazę mleczanową.

Inną znaną metodą jest biolumine-

scencyjny pomiar ATP. Wszystkie żywe
komórki zawierają ATP – nukleotyd,
który pełni rolę magazynu energii. Stę-
żenie ATP może być mierzone w prosty
sposób w reakcji z zastosowaniem lucy-
feryny i lucyferazy. W wyniku tej reakcji
wydzielane jest światło w ilościach rów-
noważnych do ilości ATP. Stosując tę me-
todę, w ciągu 1 minuty można ocenić
stan sanitarny powierzchni.

Test LAL jest szybką metodą wykrywa-

nia endotoksyn, czyli obecności bakterii
G(-). Składają się one z kompleksów lipi-
dów i polisacharydów o różnym składzie
chemicznym. Techniki radiometryczne
są oparte na pomiarze pobierania lub
znakowania substratów lub produktów.
Najczęściej stosowane metody radio-
metryczne wykorzystują pomiar

14

CO

2

– tworzonego przez mikroorganizmy
w wyniku metabolizowania znakowanych
izotopowo substratów, np. glukozy czy
laktozy, wprowadzonych do podłoża
hodowlanego. Szybkość czasu detekcji
jest skorelowana z początkową liczbą
mikroorganizmów w badanej próbie.
Trudność w usuwaniu odpadów izoto-
powych wyklucza tę metodę z zastoso-
wań w analizie żywności. Różnicowanie
do rodzajów możliwe jest na podstawie
analizy lotnych produktów końcowych
przy pomocy chromatografii gazowej.
Można stosować ją do bakterii z rodza-
ju Bacillus i Clostridium. W przypadku
oznaczeń dotyczących grzybów możliwa

jest charakterystyka ściany komórkowej,
która zawiera chitynę, oraz membran
cytoplazmatycznych, zawierających er-
gosterol. Poziom ergosterolu świadczy
o jakości żywności i może być oznacza-
ny za pomocą chromatografii HPLC,
chromatografii gazowej i cienkowarstwo-
wej oraz spektrometrii w ultrafiolecie
i podczerwieni.

NAJNOWOCZEŚNIEJSZE
METODY

Biologia molekularna stanowi najno-
wocześniejsze narzędzie do oznaczeń
mikrobiologicznych. Można stosować
sondy, które łączą się z określonym
mikroorganizmem, wirusem czy też
specyficznym składnikiem organizmu,
a następnie wykorzystywać detekcję
kompleksu sonda – analizowany skład-
nik. Najczęściej stosowanymi sondami
są kwasy nukleinowe do detekcji DNA
lub RNA oraz cząsteczki przeciwciał
do detekcji białek, węglowodanów lub
lipidów. Jeżeli sekwencja zasad w son-
dzie jest komplementarna do sekwen-
cji charakterystycznej dla oznaczanego
mikroorganizmu, wówczas sonda wiąże

się jedynie z DNA oznaczanego mikro-
organizmu. W oznaczeniach systemu
Gene-Trak stosowane są fluorescencyj-
nie znakowane sondy DNA, natomiast
w systemie Gene-Probe wykorzystywane
są sondy znakowane akrydynowym es-
trem. W obydwu systemach oligonukle-
otydowe sondy DNA są komplementarne
wobec charakterystycznych dla anali-
zowanego mikroorganizmu sekwencji
rybosomalnego RNA. RRNA występuje
w komórce w dużej liczbie kopii, ponie-
waż jest integralną częścią bakteryjnego
rybosomu. Analiza taka składa się z czte-
rech etapów. Lizę próbki dla bakterii
G(-) powoduje zasadowe środowisko,
a dla G(+) wspomaga się ją lizozymem.
Następnie następują hybrydyzacja, zwią-
zanie hybrydu i detekcja. Do unikalnych,
sąsiadujących ze sobą regionów tej samej
cząsteczki rRNA testowanego organizmu
dodawane się dwie sondy wykazujące
homologię. Jedna umożliwia wiązanie
hybrydu z nośnikiem dzięki połącze-
niu do jej 3’ końca poli dA, natomiast
druga służy do detekcji, gdyż do jej oby-
dwu końców przyłączone są specjalne
związki chemiczne wywołujące zmianę

reklama

L A B O R A T O R I U M 5 / 2 0 0 9

|

. . .

W

L A B O R A T O R I U M

14

barwy lub luminescencję. Wstawienie
do testowanej mieszaniny stałego no-
śnika zawierającego poli dT umożliwia
wychwycenie powstających wcześniej
hybrydów. Detekcja odbywa się poprzez
pomiar zmiany barwy (Gene-Trak) lub
luminescencji (Gene-Probe) wywołanych
po zanurzeniu nośnika z przyłączonym
hybrydem w specjalnych odczynnikach.
Sondy wymagają obecności 10

5

-10

6

ko-

pii charakterystycznej sekwencji DNA.
Można to pokonać poprzez powielenie
DNA charakterystycznego mikroorga-
nizmu techniką PCR. Inną metodą jest
analiza poliformizmu miejsc restrykcyj-
nych RFLP. Polega ona na wyizolowaniu
DNA z testowanego mikroorganizmu,
trawieniu odpowiednio dobranymi en-
zymami restrykcyjnymi i rozdzieleniu
ze względu na wielkość powstających
fragmentów DNA metodą elektrofore-
zy żelowej. Następnie rozdzielane frag-
menty przenoszone są na membranę
i dodawana jest chemiluminescencyjnie
znakowana, specyficzna sonda genetycz-
na. Z różnorodności sekwencji wynika
obecność miejsc restrykcyjnych lub ich
brak, a konsekwencją tego jest hybrydy-
zacja sond z fragmentami o różnej wiel-
kości. Sondy pozwalają uzyskać rozkład
prążków unikalny dla danego szczepu
mikroorganizmu.

Metody immunologiczne bazują

na zastosowaniu przeciwciał reagujących
z antygenami obecnymi na powierzch-
ni testowanego mikroorganizmu. Naj-
powszechniej stosowaną techniką jest

TECHNOLOGIA DETEKCJI

ZALETY

WADY

Hybrydyzacja „kanapkowa” (sandwich
hybridisation) – Advantages of HybriScan®

– różnicowanie żywych/martwych komórek,

minimalna interferencja z matrycą próbki,
wysoka specyficzność,

– łatwe wiązanie (hybrydyzacja),
– możliwość oznaczania wielu próbek (płytka

z 96 mikrostudzienkami),

– oznaczenia jakościowe i ilościowe,
– detekcja mikroorganizmów nie rosnących

w warunkach laboratoryjnych

– nierozróżnianie serotypu lub podgatunku,
– limitowane przeznaczenie sondy

PCR

– duża wydajność,
– czułość,
– oznaczenia ilościowe

– brak rozróżnienia między żywymi i martwymi

komórkami,

– duża interferencja z matrycą,
– inhibicja polimerazy

ELISA

– rozróżnianie serotypu lub podgatunku,
– możliwość oznaczania wielu próbek (płytka

z 96 mikrostudzienkami),

– oznaczenia jakościowe i ilościowe

– niska czułość,
– niska specyficzność, reaktywność krzyżowa,
– wolna i droga procedura

Metody konwencjonalne
(bazujące na hodowli komórek)

– relatywnie niedrogie,
– proste procedury,
– specyficzne,
– szeroko akceptowane metody

– czasochłonne (około 10 dni),
– brak detekcji mikroorganizmów nie

rosnących w warunkach laboratoryjnych,

– niska wydajność,
– wymagają dużego nakładu pracy

Tabela 1. Wady i zalety różnych technik detekcji mikroorganizmów (na podstawie Advantages of HybriScan

®

over other detection techniques, pobrano ze strony internetowej www.sigmaaldrich.com)

metoda immunoenzymatyczna ELISA.
Przeciwciało w stosunku do testowanego
mikroorganizmu połączone jest z enzy-
mem. Po reakcji przeciwciało – antygen
obmywany jest nadmiar przeciwciała,
a obecność organizmu może być stwier-
dzona przez dodanie odpowiedniego
substratu, zmieniającego kolor w obec-
ności enzymu. Zmiana koloru dowodzi
obecności danego organizmu. W technice
immunologicznej stosowane są latekso-
we, różnokolorowe kuleczki, specyficzne
dla poszczególnych mikroorganizmów.
Obecność testowanych organizmów
w roztworze powoduje łączenie się
ze sobą kuleczek ze względu na reakcję
przeciwciała z antygenami obecnymi
na powierzchni drobnoustrojów, co jest
widoczne w formie powstających agrega-
tów. Przeciwciała mogą być przyłączone
do kuleczek magnetycznych i wówczas
komórki testowanych organizmów będą
się z nimi łączyć. Magnes umieszczony
pod pojemnikiem z testowaną próbką
powoduje przyciąganie kuleczek wraz
z testowanymi drobnoustrojami i oczysz-
czenie roztworu. Immunomagnetyczna
separacja usuwa określone mikroorga-
nizmy i stosowana jest do usuwania
komórek Salmonella z przypraw i E. coli
0157:H7 z żywności. Jeśli przykłado-
wo przeciwciała szczepów Salmonella
połączymy z czerwonymi kuleczkami,
a z niebieskimi – przeciwciała Listeria
spp., to istnieje możliwość identyfiko-
wania obecności kilku rodzajów mikro-
organizmów.

Kolejną metodę stanowi identyfikacja

widma w podczerwieni, które jest odzwier-
ciedleniem składu chemicznego komórek
mikroorganizmów. Reprezentuje ono biał-
ka, elementy ściany komórkowej i błony
cytoplazmatycznej oraz kwasy nukleinowe.
Analiza korelacji widm umożliwia różnico-
wanie szczepów. Jednakże niektóre z obser-
wowanych prążków mogłyby już obecnie
być przypisane grupom funkcyjnym okre-
ślonych związków chemicznych struktur
komórkowych. Widma w podczerwieni
są unikalne dla poszczególnych organizmów,
więc dysponując odpowiednimi bazami
danych, można je porównać, i obliczając
współczynnik korelacji, ustalić przyna-
leżność diagnostyczną mikroorganizmu.

Szybką i wiarygodna metodą identy-

fikacji i klasyfikacji mikroorganizmów
jest spektrometria MALDI-TOF (matrix-
-assisted laser desorption/ionization-time
of flight). Współczesne systemy spektrome-
trii MALDI-TOF umożliwiają wykonanie
analizy pozwalającej na jednoznaczną
identyfikację bakterii, drożdży czy grzy-
bów w ciągu kilku minut.

Zalety i wady wybranych technik de-

tekcji mikroorganizmów przedstawiono
w tabeli 1. Wybór właściwej techniki
warunkowany jest czasem, jakim dyspo-
nuje się do momentu uzyskania wyniku,
ściśle sprecyzowanym celem i zakresem
identyfikacji, liczbą próbek oraz akcep-
towanymi kosztami analiz.



Piśmiennictwo dostępne na stronie

www.laboratorium.elamed.pl

Piśmiennictwo

1. Stanley P.E., McCarthy B.J., Smither R.: ATP – Luminescence rapid methods

in microbiology. Blackwell Sci. Pub., Oxford 1989.

2. Barker J.M., Griffiths M.W., Collins-Thompson D.L.: Bacterial bioluminescence

applications in food microbiology. „J. Food Prot.”, 1992, 55, 62-70.

3. Czajkowska D.: Nowoczesne metody diagnostyczne w mikrobiologii żywności.

Materiały Konferencji Naukowej „Bezpieczeństwo mikrobiologiczne produkcji

żywności”, PTTŻ, Warszawa 1997, 83-93.

4. Czaczyk K., Trojanowska K.: Zastosowanie szybkich metod oznaczania i

identyfikacji drobnoustrojów. „Przemysł Spożywczy”, 2006, 2, 14-21.

5. Palka R.: Zastosowanie osiągnięć biologii molekularnej w mikrobiologii

żywności. „Przemysł Spożywczy”, 2007, 2, 6-8.

6. Sałek A.: Nowoczesne metody badań mikrobiologicznych. „Przemysł

Spożywczy”, 2004, 2, 28-32.

7. Ilinicka-Olejniczak O., Hornecka D.: Prognozowanie w mikrobiologii żywności.

„Przemysł Spożywczy”, 1995, 2, 57-58.

8. HybriScan

®

Rapid Test Systems.

Materiały reklamowe

on-line,

www.sigmaaldrich.com.

9. Meng J., Doyle M.P.: Introduction. Microbial food safety. „Microbes and

Infection”, 2002, 395-397.