INŻYNIERIA GENETYCZNA

ĆWICZENIE 2

„Fingerprinting DNA: Analiza Southern Blot”

Opracowanie:

Dominika Milczarek

Iwona Milewska

Katarzyna Nowak

Natalia Olszewska

Katarzyna Osmańska

Sylwia Perka

Karolina Robak

Aleksandra Roman

Katarzyna Seliga

Aleksandra Węcławska

WSTĘP TEORETYCZNY

Polimorfizm genetyczny jest to występowanie w populacji genomów różnych form allelicznych z częstością wyższą niż by to wynikało z tempa mutacji. Częstość tą umownie wyznaczono na 1%.

Najczęściej występującym rodzajem polimorfizmu jest SNP, czyli różnice w budowie materiału genetycznego ograniczone do jednego lub kilku nukleotydów. Różnica może być wynikiem delecji, insercji lub substytucji- tranzycji lub transwersji. Tempo tego rodzaju mutacji wynosi1-4×10^-9na nukleotyd na rok. SNP występują średnio raz na 1000 nukleotydów i ze względu na niewielkie tempo mutacji uważane są za markery bialleliczne.

Inny rodzaj polimorfizmu uwarunkowany jest obecnością sekwencji powtarzalnych. Mogą to być sekwencje rozproszone np. Alu, LINE 1, lub powtórzenia tandemowe-mini i mikrosatelity.

Minisatelity zbudowane są z sekwencji o długości 10-100 nukleotydów powtórzonych kilka do kilkuset razy. Zlokalizowane są głównie na końcach chromosomów, więc mają ograniczoną przydatność do mapowania chromosomów. Polimorfizm sekwencji minisatelitarnych (VNTR) jest za to wykorzystany w metodach identyfikacyjnych. Jeden marker VNTR może mieć wiele alleli

Mikrosatelity (STR) w porównaniu do minisatelitów charakteryzują się krótszymi sekwencjami repetetywnymi (2-6 nukleotydów) i mniejszą ilością powtórzeń. W genomie człowieka rozłożone są mniej więcej równomiernie występują średnio co 6-10 kpz.

Polimorfizm DNA może być wykorzystywany w badaniach ewolucyjnych, filogenetycznych, diagnostyce chorób genetycznych, analizie pokrewieństwa i genetyce sądowej. W zależności od informacji, jakie chce się uzyskać w wyniku analizy wybiera się odpowiednie markery. Np. SNP sprawdzają się w analizie zdegradowanego DNA pochodzącego np. od ofiar katastrof masowych lub ze szczątków kopalnych. STR sprawdzają się w badaniach identyfikacyjnych, mogą również służyć diagnostyce schorzeń genetycznych np. choroby Huntinghtona.

Enzymy restrykcyjne zwane także endonukleazami restrykcyjnymi są odpowiedzialne za zjawisko występujące u bakterii zwane „kontrolowaną przez gospodarza modyfikacją restrykcyją” lub „modyfikacją fenotypową”.

Enzymatyczne systemy „restrykcji/modyfikacji” lub „restrykcji/metylacji” podzielono na trzy kategorie:

• Systemy typu I i III posiadają enzymy jednocześnie zdolne do restrykcji i metylacji, składają się z dwóch bądź trzech podjednostek

• System typu II charakteryzuje istnienie oddzielnych enzymów restrykcji i metylacji.

Z grupy tej wywodzą się enzymy wykorzystywane powszechnie w biologii molekularnej:

• Enzymy restrykcyjne i metylacyjne typu II wymagają obecności jonów Mg²⁺

• Enzymy restrykcyjne typu II charakteryzują się krótką, często palindromowe sekwencją rozpoznawaną. Przecinają one DNA w obrębie rozpoznawanej sekwencji

• Wyróżnia się jeszcze enzymy klasy IIs, rozpoznające krótkie sekwencje rzadko palindromowe, przecinają bądź co częstsze obie nici DNA w miejscu odległym od miejsca rozpoznawanego

• Enzymy restrykcyjne rozpoznają specyficzne sekwencje o różnej długości i składzie zasad. Typowe miejsce rozpoznawane przez enzym restrykcyjny jest zwykle palindromem o podwójnej osi symetrii.

Cięcie enzymem restrykcyjnym może generować kilka typów zakończeń przeciętego DNA. Zwykle na końcu 5' znajduje się grupa fosforanowa, a na końcu 3' grupa hydroksylowa. Niektóre enzymy (Nci I) generują fosforan na końcu 3' i grupę hydroksylową na końcu 5'. Enzymy restrykcyjne rozpoznające sekwencje palindromowi zwykle przecinają rozpoznawane miejsce generując jednoniciowe wystające odcinki na 5' lub 3' końcu - tzw. „lepkie końce” lub przecinają obie nici w tym samym miejscu generując tzw. „tępe końce”.

Hybrydyzacja polega na tworzeniu podwójnej helisy między komplementarnymi niciami badanego DNA lub RNA a sondą molekularną. Techniki hybrydyzacji kwasów nukleinowych pozwalają na wykrycie i pomiar stężenia specyficznych sekwencji kwasu nukleinowego z wykorzystaniem znakowanej sondy DNA. Przed rozpoczęciem hybrydyzacji DNA lub RNA należy wyizolować i oczyścić preparat kwasów nukleinowych. Ważne jest, aby nie zanieczyścić próbki nukleazami, które zdegradują, cząsteczki kwasów nukleinowych. Należy więc dezaktywować nukleazy, np. przy pomocy DEPC (dietylopirowęglan).inkubację próbki, z proteinazą K, lub traktowanie jej tiocyjanianem guanidyny, która denaturuje białka. Można też dodać związku takiego jak, merkaptoetanol, który redukuje mostki dwusiarczkowe chroni się badany materiał przed RNazami endogennymi. Do metod hybrydyzacyjnych zaliczamy m.in.:

1. Analiza hybrydyzacji w roztworach, głównie w badaniach nad budową i strukturą genomów.

2. Hybrydyzację in situ, w której badaną tkankę inkubuje się z sondą w postaci znakowanego kwasu nukleinowego. Nadmiar sondy odmywa się i określa lokalizację tej jej części, która uległa hybrydyzacji. Jest to metoda o wysokiej czułości i specyficzności.

3. Hybrydyzacja na stałym nośniku:

• Metodę Southerna, oparta na elektroforetycznym rozdziale fragmentów DNA, które potem przenosi się na filtr nitrocelulozowy i inkubuje z sondą znakowaną DNA, co ma na celu wykrycie tych fragmentów DNA, które są komplementarne do sondy

• Metodę Northern, będąca analogiczna metoda, z tym że analizie podawane jest RNA i dostarcza informacji o ekspresji genów,

• Hybrydyzacja punktowa w której DNA jest bezpośrednio nakładany na membranę, unieruchamiany przez ogrzewanie bądź UV a następnie inkubowany z sondą molekularną

• DNA fingerprinting

Stosowane sondy są zdolne do wybiórczego wiązania się z sekwencjami do nich komplementarnych. Odpowiednio przygotowana i zastosowana w warunkach optymalnych sonda molekularna rozpoznaje sekwencje różniące się kilkoma nukleotydami i tworzy trwałe wiązania z wyłącznie komplementarnym fragmentem kwasu nukleinowego. Pozwala to specyficznie wykrywać interesujące nas sekwencje mimo obecności dużej ilości innych nie komplementarnych cząsteczek. W diagnostyce molekularnej stosowane są krótkie lub długie sondy molekularne, mogą to być syntetyczne oligomery, syntetyczne bądź naturalne geny lub ich fragmenty, cDNA, fragmenty chromosomów lub całe genomy bakteryjne. Sondy wyznakowane są radioaktywnie, enzymatycznie lub fluorochemicznie a czułość badań zależy od sposobu znakowania sondy. Niezależnie od wariantu technicznego wyróżniamy kilka charakterystycznych etapów hybrydyzacji: unieruchomienie denaturowanego DNA lub RNA na membranie, inkubowanie w roztworze sondy, odpłukanie niezwiązanej sondy, wykrywanie hybrydów,np. przez autoradiografię.

Hybrydyzacja metodą Southerna

Metoda Southerna jest jedną z najczęściej stosowanych metod hybrydyzacji DNA:DNA Podczas przygotowywania DNA do metody Southerna tnie się je enzymem restrykcyjnym na fragmenty restrykcyjne. Pozbawione struktur drugorzędowych próbki mogą zostać rozdzielone pod względem masy cząsteczkowej w żelu agarozowym . W metodzie Southerna, DNA w żelu jest nadal dwuniciową należy, więc je denaturować przed hybrydyzacją, gdyż sonda wiąże się tylko do jednoniciowych struktur. Po procesie elektroforezy DNA lub RNA należy przenieś na membranę nitrocelulozową lub nylonową i przeprowadzić hybrydyzację. Możemy wyróżnić 5 rodzajów transferu:

• Kapilarny transfer ku górze

• Kapilarny transfer ku dołowi

• Spontaniczny transfer do dwóch membran

• Elektroforeza

• Transfer w próżni

Sondy stosowane w hybrydyzacji Southerna znakowane są najczęściej radioaktywnie (³²P). Przygotowanie takiej sondy polega na odzyskaniu przy pomocy trawienia z wektora molekularnego, najczęściej plazmidu interesującej nas sekwencji. Fragmenty restrykcyjne, czyli matryce z wektora są następnie znakowane z użyciem losowych heksametrów lub oligo-T. Znakowanie odbywa się poprzez syntezę nowych nici badanej poszukiwanej sekwencji na matrycy sekwencji z wektora. Denaturowane termicznie matrycowe DNA mieszamy z mieszaniną losowych heksametrów. Heksamery te parują ze wszystkimi komplementarnymi miejscami, jakie odnajdą na matrycy a polimeraza DNA rozpoczyna syntezę nowych nici przy pomocy dATP, dGTP, dTTP, dCTP. Siła sygnału sondy radioizotopowej w hybrydyzacji zależy od immobilizacji DNA, komplementarności sond i ich specyficzności oraz ilości DNA na membranie.  Co raz częściej w procesie znakowania sond molekularnych radioizotopy fosforu zastępowane są ligandami rozpoznawanymi przez swoiste przeciwciała skoniugowane z  enzymem. Sondy znakowane digoksygeniną, dinitorfenolem, bromodeoxyurydyną, biotyną, streptawidyną w których wykrycie ligandu przebiega z zastosowaniem reakcji immunochemicznych i kolorymetrii, jak również sondy dla których końcowym sposobem detekcji jest chemiluminescencja znajdują coraz szersze zastosowanie. Do enzymów reporterowych możemy zaliczyć alkaliczną fosfatazę, peroksydazę chrzanową, β-galaktozydazę, 9oksydazę ksantynową, oksydazę glukozową.

DNA fingerprinting jest odmianą metody Southerna mającą zastosowanie w diagnostyce. Pozwala ona uwidocznić po przez hybrydyzację z sondą molekularną proste nukleotydowe powtórzenia, charakterystyczne dla poszczególnych osobników w populacji. DNA fingerprinting stosowany jest na przykład w badaniach dotyczących wykrywania ojcostwa.

CEL ĆWICZENIA

Celem ćwiczenia jest poznanie metody hybrydyzacyjnej analizy kwasów nukleinowych na przykładzie metody Southern Blot.

PRZEBIEG ĆWICZENIA

I. Elektroforeza w żelu agarozowym

1. Przygotowaliśmy 100ml 0,8% roztworu agarowy w 1x stężonym buforze do elektroforezy (stężenie wyjściowego roztworu - 50x)

2. Po schłodzeniu żelu do temp. 55ºC, wylaliśmy żel na saneczki, uformowaliśmy kieszonki i pozostawiliśmy do zastygnięcia

3. Zatężały żel zalaliśmy 2L 1x stężonego buforu do elektroforezy

4. Po wyjęciu grzebieni, nałożyliśmy do kieszonek 35-40µl odpowiednich próbek DNA wg wzoru:

Pierwszy rząd:

1. A DNA standardowy

2. B DNA matki cięte enzymem 1

3. C DNA matki cięte enzymem 2

4. D DNA dziecka cięte enzymem 1

5. E DNA dziecka cięte enzymem 2

Drugi rząd:

1. A DNA standardowy

2. F DNA ojca I cięte enzymem 1

3. G DNA ojca I cięte enzymem 2

4. H DNA ojca II cięte enzymem 1

5. I DNA ojca II cięte enzymem 2

5. Elektroforezę prowadziliśmy ok. 1h przy napięciu 90V

6. Po zakończeniu elektroforezy nacięliśmy prawy górny róg żelu

7. Wybarwiliśmy żel w bromku etydyny i obejrzeliśmy wyniki w świetle UV

8. Po zanotowaniu wyników i identyfikacji odpowiednich pasm DNA, przepłukaliśmy żel w wodzie destylowanej

II. Przeniesienie DNA na membranę (Southern Blot Transfer)

Depurynacja / denaturacja

1. Po przepłukaniu żel agarozowy przenieśliśmy do kuwety zawierającej 200ml 0,25M HCl i pozostawiliśmy na 8 min. w temperaturze pokojowej

2. Po zlaniu roztworu HCl, przemyliśmy żel kilkakrotnie wodą destylowaną

3. Dodaliśmy 200ml roztworu denaturującego DNA (0,5M/0,6M NaCl) i moczyliśmy żel 15 minut

4. Po zlaniu roztworu, czynność powtórzyliśmy, tym razem mocząc żel 30minut.

Sothern Blot Transfer

1. Po 30 minutowej inkubacji w roztworze denaturującym, żel wyjęliśmy z kuwety, a roztwór zachowaliśmy do zwilżenia membrany nylonowej

2. Umieściliśmy żel kieszonkami do dołu, tak by odwrócona, gładka powierzchnia żelu mogła się kontaktować z membraną

3. Przycięliśmy membranę do rozmiarów żelu i analogicznie jak w przypadku żelu odcięliśmy jej górny róg

4. Tak przygotowaną membranę zwilżyliśmy w zachowanym wcześniej roztworze denaturującym DNA

5. Nasyconą membranę przenieśliśmy na wierzch odwróconego żelu agarozowego

6. Następnie na membranę nałożyliśmy przyciętą do jej rozmiaru bibułę filtracyjną

7. Na bibule filtracyjnej umieściliśmy warstwę ręczników papierowych o grubości około 3-4cm. Obciążyliśmy powstały stos i pozostawiliśmy na całą noc

Zakończenie transferu (Stopping point)

1. Po całonocnej inkubacji usunęliśmy obciążniki i papierowe ręczniki

2. Odwróciliśmy stos zawierający żel, membranę nylonową i bibułę filtracyjną, tak by bibuła znalazła się na spodzie, a następnie ostrożnie przy pomocy szczypiec usunęliśmy żel z membrany

3. Membranę umieściliśmy pomiędzy dwa arkusze bibuły i włożyliśmy do piecyka nagrzanego do temperatury 80ºC na 30 min.

III. Nieizotopowa detekcja DNA

Blokowanie niespecyficznych miejsc wiązania (Membrane shielding)

1. Membranę umieściliśmy stroną zawierającą DNA do góry - na 5min. w kuwecie z 100ml rozcieńczonego buforu J

2. Podczas moczenia membrany ogrzewaliśmy 50ml buforu K w 65ºC aż do momentu rozpuszczenia

3. Przytrzymując membranę szczypcami, zlaliśmy bufor J z kuwety

4. Do butli hybrydyzacyjnej włożyliśmy membranę (umieściliśmy ją stroną z DNA do góry), dodaliśmy 50ml ogrzanego buforu K i inkubowaliśmy w piecyku w temperaturze 65ºC przez 1h

Detekcja

1. Po godzinnej inkubacji wyjęliśmy butlę hybrydyzacyjną z piecyka, zlaliśmy z butli bufor K i wyjęliśmy z niej membranę

2. Następnie umieściliśmy membranę w kuwecie stroną z DNA do góry

3. Do czystej zlewki dodaliśmy 10ml rozcieńczonego buforu J i 8µl SAAP (P), wymieszaliśmy, a następnie zalaliśmy membranę

4. Inkubowaliśmy w temperaturze pokojowej przez 10minut, co jakiś czas ruszając kuwetą, tak żeby membrana była cały czas w roztworze

5. Następnie wyjęliśmy na chwilę membranę i przepłukaliśmy kuwetę wodą destylowaną, po czym umieściliśmy membranę z powrotem w kuwecie

6. Do kuwety dodaliśmy 400ml rozcieńczonego buforu J, inkubowliśmy przez 20minut, co jakiś czas poruszając kuwetą, a następnie roztwór zlaliśmy.

7. Do kuwety dodaliśmy 200ml rozcieńczonego buforu J, inkubowliśmy przez 15minut, co jakiś czas poruszając kuwetą, roztwór zlaliśmy. Czynność powtórzyliśmy.

8. Podczas ostatniego przemywania buforem J przygotowaliśmy roztwór wywołujący barwę.

Wywoływanie barwy

1. Roztwór wywołujący barwę przygotowaliśmy przez rozpuszczenie tabletki BCIP/NBT w 20ml wody destylowanej

2. Po ostatnim zlaniu buforu J wyjęliśmy membranę

3. Do szalki Petriego dodaliśmy 10ml roztworu wywołującego barwę i do tego roztworu włożyliśmy membranę stroną z DNA do dołu

4. Inkubowaliśmy w 37ºC w ciemności przez kilka godzin

Terminacja

1. Do kuwety przemytej wodą destylowaną dodaliśmy 100ml rozcieńczonego roztworu M., przełożyliśmy do niej membranę i chroniąc ją przed silnym bezpośrednim światłem - moczyliśmy przez 5 minut

2. Membranę suszyliśmy w piecyku w 80ºC

3. Zanotowaliśmy wyniki

Obliczenia

Elektroforeza w żelu agarozowym w celu oceny analizowanych próbek DNA.

Przygotowano 100 ml 0,8% żelu agarozowego w buforze 1xTAE według następujących obliczeń.

Objętość buforu:

1/50*100 ml= 2ml TAE

Masa agarozy:

0,8 g - 100 ml

x g - 100 ml

x = 0,8 g

Objętość buforu potrzebnego do prowadzenia elektroforezy:

1/50*2000 ml= 40ml TAE uzupełniono wodą destylowaną do objętości 2L

Nieizotopowa detekcja DNA

W celu zablokowania niespecyficznych miejsc wiązania przygotowano bufor J.

Roztwór wyjściowy był 20x stężony.

1/20 * 100mL = 5mL buforu J - uzupełniono wodą destylowaną do 100mL

A następnie bufor K

Roztwór wyjściowy był 20x stężony.

1/20 * 50mL = 2,5mL buforu J - uzupełniono wodą destylowaną do 50mL

Detekcja

W celu detekcji produktów hybrydyzacji przygotowano bufor J.

Roztwór wyjściowy był 20x stężony.

1/20 * 10mL = 0,5mL buforu J - uzupełniono wodą destylowaną do 10mL

A następnie bufor SAAP(P)

Roztwór wyjściowy był 20x stężony.

1/20 * 8μL = 0,4μL buforu P - uzupełniono wodą destylowaną do 8μL

Po czym ponownie przygotowywano bufor J

1/20* 200mL = 10ml - uzupełniono wodą do objętości 200mL

WYNIKI

Wynik elektroforezy w świetle UV.

Obraz membrany po hybrydyzacji:

Pierwszy rząd:

A DNA standardowy

B DNA matki cięte enzymem 1

C DNA matki cięte enzymem 2

D DNA dziecka cięte enzymem 1

E DNA dziecka cięte enzymem 2

A	B	C	D	E

Obraz membrany po hybrydyzacji:

Drugi rząd:

A DNA standardowy

F DNA ojca I cięte enzymem 1

G DNA ojca I cięte enzymem 2

H DNA ojca II cięte enzymem 1

I DNA ojca II cięte enzymem 2

A	F	G	H	I

WNIOSKI:

• Obraz elektroforezy na żelu agarozowym jest rozmyty i niedokładny, widoczne są smugi. Ich obecność może wynikać z degradacji DNA lub zanieczyszczeń znajdujących się w próbce.

• Obraz prążków na membranie nylonowej jest dostatecznie wyraźny aby odczytać położenie prążków każdej próbki. Prążki pokrywają się z obrazem z żelu.

• Na podstawie obrazu z membrany nylonowej nie jesteśmy w stanie wykluczyć ojcostwa któregokolwiek z badanych mężczyzn (potrzebna jest większa ilość danych).

---