Ćwiczenia z inżynierii genetycznej

Sprawozdanie z ćwiczenia 3

Transformacja bakterii Escherichia coli plazmidowym DNA.

Wykonały:

Dominika Milczarek

Natalia Olszewska

Katarzyna Osmańska

Aleksandra Roman

Aleksandra Węcławska

I Wstęp teoretyczny

Transformacja - zjawisko i proces aktywnego pobierania DNA, zwykle plazmidowego DNA, przez organizmy jednokomórkowe, najczęściej bakterie i drożdże. Transformacja pełni u bakterii funkcję namiastki procesu płciowego, umożliwiając wymianę genów, często nawet między odległymi organizmami.

Zjawisko transformacji ma ogromne znaczenie medyczne, gdyż geny warunkujące lekooporność są wymieniane na plazmidach, znacznie przyspieszając rozprzestrzenianie się oporności na antybiotyki. Transformacja ma rozległe zastosowanie w technikach biologii molekularnej. Jest używane do klonowania genów, powielania plazmidowego DNA, wymuszonej ekspresji obcych genów w organizmach jednokomórkowych, itd..

Zdolność do transformacji nazywa się kompetencją.

Kompetencja polega na syntezie niskocząsteczkowego białka - czynnika kompetencji. Jest uwarunkowana genetycznie, zależy od stanu fizjologicznego komórek i od fazy wzrostu. Naturalnie bakterie i drożdże mają stosunkowo niską kompetencję. W celach eksperymentalnych kompetencja może być podwyższona przez traktowanie organizmów roztworami soli zawierających kationy Ca²⁺ lub Rb⁺.

Po transformacji należy wyselekcjonować te klony, które zawierają wektor połączony poprawnie z insertem. Metody selekcji to:

1. Identyfikacja klonów z wektorem plazmidowym. Pojedyncza komórka bakterii po transformacji, czyli przyjęciu wektora kodującego gen selekcyjny, uzyskuje zdolność do wzrostu na pożywce z antybiotykiem, dając początek kolonii identycznych komórek z powielonymi cząsteczkami wektora.

2. Identyfikacja klonów z wektorem fagowym. Komórki po transformacji wektorem fagowym wylewane są na szalkę selekcyjną pozbawioną antybiotyku, dzięki czemu wszystkie komórki ulegają podziałom. Fagi obecne w pojedynczych, stransformowanych komórkach po namnożeniu infekują komórki sąsiednie. Obszary zajęte przez zainfekowane komórki, widoczne są na tle pozostałych komórek dzięki słabszemu wzrostowi tworząc obszary zwane pseudołysinkami, np. fag M13. W przypadku, gdy wektor fagowy prowadzi do lizy komórek,

np. fag λ, obszary zainfekowane tworzą tzw. łysinki.

3. Spośród klonów bakeryjnych zawierających wektor należy wyselekcjonować te klony, w których wektor połączony jest z insertem. W tym celu, zarówno w przypadku wektorów plazmidowych jak i fagowych, wykorzystywane są następujące techniki:

a. Test α-komplementacji. W wielu wektorach genetycznych polilinker zlokalizowany jest pomiędzy promotorem operonu laktozowego a sekwencją kodującą 3' fragment genu markerowego, β-galaktozydazy (gen lacZ'). Fragment ten koduje polipeptyd uzupełniający uszkodzony gen tego enzymu obecny w genomie szczepów E.coli używanych do transformacji. W wektorach pozbawionych insertu, polipeptyd kodowany

przez wektor ulega ekspresji a powstające białko w kompleksie z podjednostką kodowaną przez genom bakteryjny, zamienia syntetyczny substrat obecny w pożywce, X-Gal (5-bromo-4-chloro-3-indolo-Dgalaktozyd) na produkt, który nadaje kolonii barwę niebieską. Wprowadzenie insertu do polilinkera prowadzi do inaktywacji genu markerowego, w efekcie czego kolonia ma barwą białą. Aktywność genu β-galaktozydazy indukujemy dodając do pożywki IPTG (izopropylotiogalaktozyd), syntetyczny induktor, który

blokuje represor lac.

b. Elektroforeza i analiza restrykcyjna DNA. Z klonów uzyskanych po transformacji izolujemy plazmidowy DNA a następnie porównujemy jego migrację elektroforetyczną z pustym wektorem. Wklonowany insert powoduje opóźnienie migracji wektora. Ponadto, w celu sprawdzenia długości wklonowanego insertu możemy go wyciąć z wektora przy użyciu odpowiednich enzymów restrykcyjnych a następnie oszacować jego wielkości na podstawie elektroforezy z wzorcem mas cząsteczkowych.

c. PCR. Jeżeli dysponujemy starterami specyficznymi dla sekwencji insertu, możemy je wykorzystać do reakcji PCR, w których matrycą jest DNA poszczególnych klonów bakteryjnych po transformacji. Jeżeli nie dysponujemy starterami specyficznymi dla insertu, możemy użyć starterów przyłączających się do sekwencji po obu stronach polilinkera, np. M13, T7, SP6. Startery te umożliwią amplifikację insertu, ewentualnie pustego polilinkera.

d. Hybrydyzacja kolonijna. Test ten wykonuje się na ogół w celu identyfikacji w bibliotekach cDNA lub genomowych klonu zawierającego poszukiwaną sekwencję, tzw. przegląd. Do hybrydyzacji kolonijnej znakowany DNA, o sekwencji homologicznej do insertu, wykorzystywany jest jako sonda hybrydyzacyjna.

II Cel ćwiczenia

Celem ćwiczenia jest:

• poznanie techniki transformacji komórek bakteryjnych plazmidowym DNA,

• nabycie umiejętności pracy z komórkami bakteryjnymi w warunkach jałowych,

• poznanie technik przygotowywania komórek kompetentnych,

• poznanie metod selekcji transformowanych komórek,

• poznanie sposobu liczenia wydajności transformacji.

III Przebieg ćwiczenia

Dzień I

Doświadczenie I

1. Oznaczamy dwie płytki paskami.

2. Rozpuszczamy medium.

3. Trzymamy medium w temp. 60°C.

4. Wylewamy jedną płytkę na całą grupę (5 ml) do wysiania bakterii w celu uzyskania pojedynczych kolonii do transformacji.

5. Dodajemy IPTG do medium i mieszamy.

6. Wylewamy dwie płytki (po 5 ml) bez oznaczania paskami.

7. Dodajemy ampicylinę do pozostałego medium i mieszamy.

8. Wylewamy dwie płytki (po 5 ml) oznaczone paskami.

9. Pozostawiamy płytki do zastygnięcia.

10. Przygotowujemy dwie jałowe probówki.

11. Podpisujemy probówki: „+DNA” i „-DNA” (odpowiednio z plazmidem i bez).

12. Do każdej probówki dodajemy 250 µl zimnego (trzymanego na lodzie) roztworu CaCl₂, używając sterylnej pipety 1 ml.

13. Sterylną wykałaczką przenosimy po dwie kolonie E. coli do każdej probówki z zimnym CaCl₂ i energicznie mieszamy, żeby komórki bakterii odkleiły się od wykałaczki i pozostały w roztworze w probówkach.

14. Probówki krótko worteksujemy.

15. Do probówki oznaczonej „+DNA” dodajemy 10 µl roztworu zawierającego plazmid pFluoroGreen^TM. Plazmidy DNA dodajemy bezpośrednio do zawiesiny komórek.

16. Inkubujemy probówki na lodzie przez 15 minut.

17. Przenosimy probówki do temp. 42°C i inkubujemy 90 s.

18. Ponownie (bardzo szybko) umieszczamy probówki na lodzie i inkubujemy przez 2 minuty.

19. Używając sterylnej pipety dodajemy do każdej probówki 250 µl pożywki Luria Recovery Broth i mieszamy.

20. Inkubujemy komórki przez 30 minut w temp. 37°C.

21. Podpisujemy płytki z agarem: LB-, LB+, LB/Amp+ i LB/Amp- (minus oznacza brak plazmidu, plus obecność plazmidu DNA).

22. Po inkubacji wyjmujemy płytki z łaźni wodnej i umieszczamy je w statywie.

23. Używając sterylnej pipety 1 ml przenosimy po 0,2 ml roztworu komórek z probówki oznaczonej „-DNA” na środek płytek z agarem, opisanych LB- i LB/Amp-.

24. Ezą rozprowadzamy komórki po całej powierzchni płytek.

25. Przykrywamy płytki i czekamy aż płyn zostanie zaabsorbowany przez podłoże agarowe.

26. Używając sterylnej pipety 1 ml przenosimy po 0,2 ml roztworu komórek z probówki oznaczonej „+DNA” na środek płytek z agarem, opisanych LB+ i LB/Amp+.

27. Ezą rozprowadzamy komórki po całej powierzchni płytek.

28. Przykrywamy płytki i czekamy aż płyn zostanie zaabsorbowany przez podłoże agarowe.

29. Wszystkie płytki (4 sztuki) zestawiamy jedna na drugą, stroną z agarem do góry, sklejamy boki płytek plastrem.

30. Płytki w odwróconej pozycji inkubujemy w temp. 37°C przez całą noc (15-20 godzin).

Doświadczenie 2

1. Przygotowujemy medium LB (30 ml)

• 0,3 g Bactotrypton

• 0,15 g Bactoyeast Extract

• 0,15 g NaCl

• woda do 30 ml

• Dostosować pH do 7 za pomocą NaOH

Przygotowujemy płytki LB (na 30 ml)

• 0,45 g agaru

• autoklawujemy

• ochładzamy do 50°C

• wylewamy po 30 ml na płytki Petriego

• zostawiamy do stwardnienia

• Przygotowujemy TYP Broth Medium (na 50 ml)

• 0,8 g Bactotrypton

• 0,8 Bactoyeast Extract

• 0,5 g NaCl

• 0,25 K₂HPO₄

• Otwarte płytki eksponujemy przez 20 minut przy oknie.

• Płytki w odwróconej pozycji inkubujemy w temp. 37°C przez całą noc (15-20 godzin).

• Przenosimy wykałaczką pojedyncze kolonie do 2 ml TYP Broth Medium.

• Inkubujemy bakterie w probówkach w temp. 37°C przez całą noc (15-20 godzin).

III Wyniki i wnioski

a)




Płytkę z wylaną pożywką LB poddano 20 minutowej ekspozycji przy otwartym oknie, a następnie całonocnej ekspozycji. Celem tego doświadczenia było określenie czystości mikrobiologicznej powietrza w wybranym miejscu.

Po inkubacji nie stwierdzono na płytce wzrostu żadnej kolonii bakterii ani grzybów. Zaobserwowane skupiska tworzyły stałe zanieczyszczenia powietrza (pyłki roślin, kurz).

b)

Wykonano posiewy trzech typów bakterii do oddzielnych probówek z pożywką, następnie poddano je całonocnej inkubacji w temp. 37ºC.

W wyniku inkubacji zaobserwowano wzrost kolonii bakteryjnych w postaci zmętnienia pożywki i delikatnego osadu w każdej z probówek.

c)


Celem tego doświadczenia była ocena procesu transformacji komórek Escherichia coli plazmidami.

W badaniu wykorzystano białko Gfp, które wykazuje zdolność do emisji światła zielonego pod wpływem UV oraz ampicylinę. Ampicylina jest antybiotykiem i jednocześnie powszechnie wykorzystywanym markerem procesu transformacji. W przypadku, gdy badanie kończy się sukcesem, obserwuje się wzrost transferowanej komórki bakteryjnej na podłożu z dodatkiem antybiotyku, co wynika z pobrania przez tą komórkę genu oporności z plazmidu.

Po całonocnej inkubacji płytek z posianymi bakteriami nie zaobserwowano fluorescencji na zielono, co świadczy o tym, że transformacja mogła nie zajść. Przyczyną takiego wyniku mogą być zastosowane bakterie. Jednym z warunków powodzenia transformacji jest uzyskanie kompetentnych bakterii. Istnieją takie rodzaje, które ulegają spontanicznej transformacji, np. Bacillus, jednak w naszym doświadczeniu wykorzystano Escherichia coli, które takich właściwości nie wykazują. W przypadku tego szczepu konieczne było zastosowanie odpowiedniej procedury, zmierzającej do indukcji pożądanych właściwości. W tym celu komórki potraktowano chlorkiem wapnia. Być może opracowana procedura była nie właściwa dla tego szczepu, np. był zbyt krótki czas inkubacji z odczynnikiem, bądź użyty szczep - bardzo oporny na działanie chlorkiem wapnia. Aby się o tym przekonać komórki poddano ponownie inkubacji w tych samych warunkach.

4. Ocena jakościowa i ilościowa wyizolowanego DNA plazmidowego metodą rozdziału elektroforetycznego w żelu agarozowym.

B- DNA wyizolowane z kolonii bakteryjnych wzrastających na biało

D- DNA wyizolowane z kolonii bakteryjnych wzrastających na pomarańczowo

Z - DNA wyizolowane z kolonii bakteryjnych wzrastających na zielono

W analizowanych próbkach (kieszonki 2, 3, 4) znajdowało się wyizolowane DNA plazmidowe, co potwierdza prawidłowo wykonaną procedurę izolacji. Produkt izolacji położony był jednak blisko kieszonek, co może świadczyć o tym, ze był to produkt o dużej długości ( zgodnie z zasadami przebiegu elektroforezy im dłuższy jest produkt, tym bliżej linii startu jest położony).

Z

D

B

---