INŻYNIERIA GENETYCZNA

ĆWICZENIE 4

Amplifikacja pętli D. Trawienie produktu PCR enzymami restrykcyjnymi: SspI i MboI.

Metylacja DNA (metylaza Dam).

Opracowanie:

Dominika Milczarek

Natalia Olszewska

Katarzyna Osmańska

Aleksandra Roman

Aleksandra WęcławskaWstęp teoretyczny

Enzymy restrykcyjne (restryktazy) są endodeoksyrybonukleazami, które po rozpoznaniu specyficznych sekwencji nukleotydowych hydrolizują DNA poprzez zerwanie wiązania fosfodiestrowego w każdej nici dupleksu DNA. Nacięcie obydwu nici przez enzym wzdłuż jednej osi symetrii powoduje powstanie fragmentów o tzw. tępych końcach. Często hydroliza następuje wzdłuż podwójnej osi symetrii i w rejonie nacięcia powstają wtedy dwa komplementarne, jednoniciowe końce, zdolne do odtworzenia struktury dwuniciowej, tzw. lepkie końce.

Wyizolowane dotychczas enzymy restrykcyjne sklasyfikowano w trzy podstawowe grupy na podstawie mechanizmu działania, składu podjednostek, substratów, produktów i kofaktorów katalizowanego przez nie procesu. Enzymy należące do I klasy są najbardziej złożone, maja trzy typy podjednostek, wykazują aktywność nukleazy i metylazy, a efektywność ich działania uzależniona jest od obecności ATP, S-adenozylometioniny i jonów Mg²⁺ jako kofaktorów. Enzym rozpoznaje określona nie metylowaną sekwencje w obrębie dwuniciowego DNA i w pewnej odległości od niej hydrolizuje obie nici. Enzymy klasy III mają tylko dwa typy podjednostek, wymagają obecności ATP i jonów Mg²⁺ , zaś obecność S-adenozylometioniny nie jest konieczna, ale wzmacnia ich aktywność. Hydrolizują nie metylowany DNA w pewnej odległości od miejsca rozpoznanej sekwencji (średnio jest to 25 nukleotydów). II klasa enzymów stanowi najprostszy system, złożony z jednego typu podjednostek, aktywowanych jedynie obecnością jonów Mg²⁺. Hydrolizują dwuniciowy DNA w obrębie rozpoznawanej sekwencji. Sekwencja ta ma zazwyczaj postać palindromu i liczy 4 - 8 par zasad.

Metylacja DNA polega na modyfikacji zasad azotowych w łańcuchu DNA poprzez przyłączeniu grup metylowych (-CH₃) do niektórych nukleotydów (głównie nukleotydów cytozynowych). Proces ten katalizują metylazy - enzymy z grupy transferaz. Metylazy są kodowane przez odrębne od enzymów restrykcyjnych geny, łączy się je jednak z restryktazami, ponieważ rozpoznają i modyfikują te same sekwencje DNA. DNA metylowany w takiej sekwencji jest odporny na działanie odpowiedniej restryktazy, co w warunkach in vivo chroni własny DNA bakterii przed endogennym enzymem restrykcyjnym.

Cel ćwiczenia: Celem ćwiczenia jest zapoznanie się z właściwościami enzymów restrykcyjnych i ich wrażliwością na metylację.

Przebieg ćwiczenia

1. Przygotowanie reakcji amplifikacji pętli D

• Objętość końcowa reakcji wynosiła 50 µL.

• Do reakcji użyto 9 µL matrycy DNA.

Komponenty	Stężenie końcowe	Stężenie wyjściowe
Bufor	1*	10*
MgCl2	1,5 mM	25 mM
Starter R/F	30 pmoli/µL	100 pmoli/μL
DTP	25mM	0,2 mM
Polimeraza Taq	5U na reakcję	5U/µL

• Bufor

• Starter

X=0,3µL

Taką sama ilość pobrano drugiego startera.

• MgCl₂

1,5 mM * 50µL = 25 mM * x (µL)

X=3µL

dNTP's

0,2mM * 50µL = 2,5mM * x(µL)

X=0,4µL

• Polimeraza Taq

X=1L

Reakcję uzupełniono wodą destylowaną (31 µL) do objętości 50 µL.

Reakcje PCR przeprowadzono dla tej samej matrycy 2- krotnie.

2. Przeprowadzenie elektroforezy w żelu agarozowym w celu oceny jakości badanego produktu amplifikacji.

• Przygotowano 30 ml 1% żelu agarozowego w buforze 1xTAE według następujących obliczeń.

Objętość buforu do przygotowania żelu:

1/50*30ml= 0,6 mL

Masa agarozy:

1 g - 100 ml

x g - 3 ml

x = 0,3g

Objętość buforu do elektroforezy:

1/50*250= 50mL TAE uzupełniono wodą destylowaną do 250 mL.

Wynik elektroforezy:

Próbka „nasza” nr 1	Próbka „nasza” nr 2	Próbka „nasza” nr 3	Próbka „nasza” nr 4
Próbki gotowe otrzymane z laboratorium

Aby uzyskać odpowiednią ilość materiału do przeprowadzenia dalszych procedur należało wybrać cztery próbki o największej zawartości amplifikowanego fragmentu. Zostały wybrane dwie nasze próbki o numerach 3 i 4 oraz dwie gotowe próbki otrzymane z laboratorium.

3. Przygotowanie reakcji metylacji produktu PCR enzymami restrykcyjnymi.

Bufor reakcyjny dam methylase

1/10*20μL= 2μL

S-adenozylometionina

3200μM*x = 80 μM * 20 μL

X=0,5 μL

Metylaza dam

8U/ μL * x = 2U/20 μL * 20 μL

X=0,25 μL

Produkt PCR - 10 μL

Woda - 2,25 μL

Po przygotowaniu reakcji o takim składzie prowadzi się inkubację w 37°C przez 1h.

W celu zakończenia metylacji podnosi się temp. do 65°C (15 minut).

1. MboI

Bufor R

1/10*15μL= 1,5μL

Enzym MboI

1U/1U *x = 2U/15U * 15 μL

X=2 μL

Produkt PCR - 10 μL

Woda - 1,5 μL

2. SspI i MpoI

Bufor Tango

1/10*15μL= 1,5μL

Enzym SspI

1U/1U *x = 2U/15U * 15 μL

X=2 μL

Enzym MboI

1U/1U *x = 2U/15U * 15 μL

X=2 μL

Produkt PCR - 10 μL

4. Przygotowanie reakcji trawienia enzymami restrykcyjnymi

1. SspI

Bufor G

1/10*15μL= 1,5μL

Enzym SspI

1U/1U *x = 2U/15U * 15 μL

X=2 μL

Produkt PCR - 10 μL

Woda - 1,5 μL

2. MboI

Bufor R

1/10*15μL= 1,5μL

Enzym MboI

1U/1U *x = 2U/15U * 15 μL

X=2 μL

Produkt PCR - 10 μL

Woda - 1,5 μL

3. SspI i MpoI

Bufor Tango

1/10*15μL= 1,5μL

Enzym SspI

1U/1U *x = 2U/15U * 15 μL

X=2 μL

Enzym MboI

1U/1U *x = 2U/15U * 15 μL

X=2 μL

Produkt PCR - 10 μL

Restrykcji poddano dwa typy matryc DNA:

• Matrycę DNA metylowaną

• Matrycę DNA niemetylowaną

5. Przeprowadzenie elektroforezy w żelu poliakrylamidowym.*

Przygotowywano 50 ml 4% żelu poliakryloamidowego

Objętość buforu:

1/10*50 ml= 5ml

Masa poliakryloamidu:

4 g - 100 ml

x g - 50 ml

x = 2g

0,1 g bisakryloamidu

1,9g akryloamidu

Oba składniki rozpuszczono w buforze a następnie uzupełniono do objętości 50ml.

Przygotowanie buforu do zalania żelu:

1/10*500ml= 50 ml buforu

Żel wylano między szyby i wsadzono dwa grzebienie, aby powstały kieszonki. Całość pozostawiono do polimeryzacji.

* W związku z tym, że nie powiodły się próby otrzymania żelu PAA, elektroforezę przeprowadzono w żelu agarozowym a barwienie w bromku etydyny, w celu oceny wpływu metylacji na restrykcję

• Przygotowano 100 ml 4% żelu agarozowego w buforze 1xTAE według następujących obliczeń.

Objętość buforu do przygotowania żelu:

1/50*100ml= 2 mL

Masa agarozy:

4 g - 100 ml

x g - 100ml

x = 4 g

Objętość buforu do elektroforezy:

1/50*2000= 40mL TAE uzupełniono wodą destylowaną do 2000 mL.

Elektroforezę prowadzono przy następujących warunkach:

t=50 min

U=500V

Ćwiczenia w sali komputerowej

Zadanie: Stworzyć mapę restrykcyjną DNA długości 430 nukleotydów, które trawimy dwoma enzymami restrykcyjnymi: PhoI i RsaI. W wyniku trawienia otrzymano fragmenty długości 78 nukleotydów, 100 nukleotydów, 120 nukleotydów i 132 nukleotydy. W wyniku trawienia PhoI otrzymano fragmenty o długości 198 i 232 nukleotydy, natomiast w wyniku trawienia RsaI otrzymano fragmenty o długości 78, 132 i 220 nukleotydów.

Rozwiązanie zadania:

Zadanie: Sprawdzić, który fragment mtDNA ulega amplifikacji na podstawie sekwencji starterów G6 i G7.

G6

5' TCA AAG CTT ACA CCA GTC TTG TAA ACC 3'

G7

5' TTG AGG AGG TAA GCT ACA TA 3'

Sekwencja G6 jest częścią sekwencji mtDNA, natomiast sekwencja G7 jest częściowo komplementarna do sekwencji mtDNA. Na podstawie uzyskanych wyników możemy stwierdzić, że amplifikacji uległa pętla D, znajdująca się po zewnętrznej stronie starterów.

Zadanie: Znaleźć informacje na temat enzymów restrykcyjnych MboI i SspI.

MboI jest enzymem restrykcyjnym rozpoznającym sekwencję GATC, wrażliwym na metylację metylazą Dam. SspI rozpoznaje sekwencję AATATT i jest niewrażliwy na metylację metylazą Dam.

Wyniki i wnioski:

Z nałożonych próbek nie udało się uzyskać miarodajnych wyników (widoczny był jedynie marker). Spodziewany rezultat ćwiczenia miał być następujący:

- wiedząc iż SspI jest niewrażliwy na metylację obraz prążków DNA w żelu jest taki sam dla próbek metylowanych i niemetylowanych.

- enzym MboI jest wrażliwy na metylację, w związku z tym nie będzie ciął metylowanego DNA. Z tego powodu obraz prążków DNA dla próbek metylowanych i niemetylowanych jest różny.

- próbki metylowane i niemetylowane cięte jednocześnie dwoma enzymami dają różny obraz prążków - różnica wynika z wrażliwości enzymu MboI na metylację (enzym nie przeciął DNA w spodziewanych miejscach). SspI był aktywny w stosunku do obydwu próbek.

8

78

132

100

120

PhoI

RsaI

RsaI

---