Enzymologia

wykład 7 01.04.2009.

CHROMATOGRAFIA PODZIAŁOWA W TZW. ODWRÓCONYM UKŁADZIE FAZ

Faza stacjonarna - niepolarna (alkilosilany)

Faza ruchoma - polarna (woda, etanol, acetonitryl i ich mieszaniny)

Złoże chromatograficzne: żel krzemionkowy powleczony silnie hydrofobowymi łańcuchami węglowodorowymi, alkilosilanami)

CH₃

Si O Si R

CH₃

Najczęściej R to dimetylooktadecylosilan -O-Si-(OCH₃)₂(-O-C₁₈-H₃₇).

Kolumny z takim złożem nazywa się w skrócie ODS.

Łańcuchy węglowodorowe związane na powierzchni krzemionki stanowią rodzaj półpłynnej, silnie hydrofobowej otoczki.

Do celów analitycznych stosowana HPLC (ocena jakości żywności).

Związki bardziej hydrofobowe zatrzymywane są przez fazę stacjonarną, w której lepiej się rozpuszczają niż w fazie ruchomej. Elucję związanych związków hydrofobowych z kolumny przeprowadza się wzbogacając fazę polarną w mniej polarny rozpuszczalnik, np. (wodę w metanol) przez obniżenie pH => wymywanie z kationitu.

Ta zmiana fazy ruchomej na mniej polarną osłabia wiązanie cząsteczek/substancji do złoża i substancja zostaje wymyta.

IMMOBILIZACJA ENZYMÓW LUB KOMÓREK

- zespół metod umożliwiających unieruchomienie enzymów lub całych komórek w wyniku ich związania na powierzchni nośnika (adsorpcja, wiązania kowalencyjne), zamknięcie w porach żelu lub kapsułkach z półprzepuszczalnych błon bądź unieruchomienia w wyniku kowalencyjnego usieciowania.

Największe zastosowanie immobilizowanego enzymu w produkcji przemysłowej dotyczy izomerazy glukozowej.

ZALETY STOSOWANIA IMMOBILIZOWANYCH ENZYMÓW

1. możliwość wielokrotnego użycia enzymu lub użycie go w procesie ciągłym,

2. wzrost stabilności struktury białka enzymatycznego (zazwyczaj, ale nie zawsze) => czasem może to prowadzić do niekorzystnych zmian w strukturze białka => wpływ na aktywność,

=> zazwyczaj wzrasta termo- i pH stabilność, odporność na działanie czynników denaturujących => możliwość zastosowania środowiska organicznego,

3. enzym nie zanieczyszcza środowiska reakcji,

4. ograniczenie inhibicji enzymu zarówno przez substrat, jak i produkt, który jest usuwany w sposób ciągły,

5. unieruchomienie kilku kolejno działających enzymów umożliwia prowadzenie złożonych przemian w jednym reaktorze, co zwiększa wydajność i obniża koszty procesu,

6. obniżenie kosztów katalizy w skali przemysłowej i wzrost wydajności.

UTRUDNIENIA PODCZAS IMMOBILIZACJI ENZYMÓW I PÓŹNIEJ PODCZAS ICH STOSOWANIA

1. wysoki koszt otrzymania czystego preparatu enzymu (przed unieruchomieniem trzeba uzyskać czysty preparat) i później jego unieruchomienia => koszty początkowe procesu immobilizacji,

2. musi się czasem liczyć z tym, że w wyniku immobilizacji, częściowo tracona jest aktywność enzymu (immobilizowane enzymy w porównaniu do swoich natywnych form mogą mieć zmienione optymalne warunki przebiegu reakcji - zmiana optymalnego pH, temperatury, specyficzność substratowa - na ogół, ale nie zawsze, są to zmiany korzystne),

3. możliwość stopniowego zużycia nośnika/matrycy, na której unieruchamiamy enzym:

• złoże rozdrobnione przez mieszanie,

• możliwość oblepienia złoża zanieczyszczeniami => ograniczony kontakt z substratem,

• utrudniony przepływ substratu przez złoże,

• wylewanie substratu poza złoże.

Podstawowym parametrem technologicznym pozwalającym na ocenę efektywności metody immobilizacji jest STABILNOŚĆ OPERACYJNA ENZYMU - określa czas pracy enzymu, po którym zachodzi utrata ½ aktywności początkowej biokatalizatora.

Wszystkie utrudnienia można wyeliminować - jednak jest to bardzo praco- i czasochłonne.

NOŚNIK STOSOWANY DO UNIERUCHOMIENIA ENZYMÓW - CECHY:

1. nierozpuszczalny w środowisku, w którym prowadzona jest reakcja enzymatyczna (na ogół roztwór wodny),

2. odporność na degradację mechaniczną (ścieranie), chemiczną i mikrobiologiczną,

3. nietoksyczny, bierny chemicznie,

4. duża zdolność wiązania enzymu, która uzależniona jest od:

• ilości i rodzaju grup funkcyjnych, zdolnych do przyłączania białka i podatności na modyfikacje prowadzące do aktywacji nośnika,

• porowatości - liczby i powierzchni porów (na tyle duże, aby pomieścić związany substrat)

Wadą organicznych nośników jest ich niższa wytrzymałość mechaniczna w porównaniu z nieorganicznymi i słaba odporność na działanie mikroorganizmów.

Nośniki nieorganiczne są wytrzymalsze, ale mniejsza jest ich pojemność/wydajność wiązania enzymu.

METODY UNIERUCHAMIANIA ENZYMÓW

• FIZYCZNE - polegają na powstaniu między złożem a enzymem słabych oddziaływań międzycząsteczkowych (wodorowe, jonowe, siły Van der Walsa) lub polegają na zamknięciu enzymu w porach żelu lub w kapsułkach z pólprzepuszczalnych błon.

• CHEMICZNE - tworzenie wiązań kowalencyjnych między enzymem a nierozpuszczalną matrycą.

METODY	ZALETY	WADY
FIZYCZNE	zachowanie struktury enzymu, łatwość i niski koszt przeprowadzenia procesu	fakt dosyć częstego wymywania enzymu ze złoża
CHEMICZNE	większa stabilność układu enzym-nośnik	możliwa częściowa utrata aktywności enzymu - wiązania kowalencyjne mogą zmieniać strukturę białka metody kosztowne, zazwyczaj wymagające użycia dodatkowych związków sieciujących, aktywujących złoża lub enzym

METODY FIZYCZNE

1. ADSORPCJA ENZYMU NA POWIERZCHNI NOŚNIKA

• unieruchomienie enzymu na powierzchni nośnika (porowatego ciała stałego) głównie na drodze słabych oddziaływań fizykochemicznych,

• enzym adsorbuje się głównie na powierzchni wewnętrznej porów,

• ziarna nośnika powinny być małe (5μm - 1 mm), aby powierzchnia aktywna wiązania enzymu była dostatecznie duża, jednak nie mogą być zbyt małe, aby nie zwalniać reakcji,

• najprostsza metoda immobilizacji.

2. PUŁAPKOWANIE W PORACH ŻELU - pułapkowanie (inkluzja) enzymu wewnątrz struktury naturalnych lub syntetycznych polimerów

• polega na polimeryzacji żelu (polimeryzacji monomerów i ich usieciowaniu w strukturę żelu) w obecności enzymu i zamknięciu enzymu w porach żelu,

• podczas tworzenia sieci polimerów cząsteczki enzymu zostają zamknięte,

• struktura zamknięta z założenia uniemożliwia wymywanie enzymu, natomiast mniejsze substraty i produkty mogą swobodnie dyfundować na zewnątrz żelu.

ZALETY:

• proces tani,

• niewymagany wysoki stopień oczyszczenia enzymu.

WADY:

• możliwość immobilizacji enzymów katalizujących przemiany substratów niskocząsteczkowych (możliwość dyfundowania do i z struktury żelu) => metoda nieodpowiednia np. do immobilizacji peptydaz (substratem są białka - makrocząsteczki), amylaz (skrobia),

• enzymy hydrolityczne mogą powodować degradację polimerów żelu.

Schemat powstawania żelu poliakrylamidowego

Rozmiary porów żelu zależą od stężenia monomerów akrylamidu i czynnika sieciującego bis-akrylamidu oraz od proporcji akrylamidu do bis-akrylamidu.

Np. pułapkowanie α-amylazy w nośniku poliakrylamidowym.

3. IMMOBILIZACJA Z WYKORZYSTANIEM PÓŁPRZEPUSZCZALNYCH MEMBRAN

1. kapsułkowanie i mikrokapsułkowanie - zamykanie enzymów we wnętrzu półprzepuszczalnej kapsułki, która imituje naturalne błony biologiczne,

2. enzymatyczne reaktory membranowe - zamykanie enzymów w przestrzeni pomiędzy półprzepuszczalnymi membranami lub w wężach (np. silikonowych, nylonowych).

W obu przypadkach membrana stanowi przegrodę uniemożliwiającą przenikanie enzymu, ale pozwalającą na przepływ substratów i produktów reakcji enzymatycznej.

Często reakcje enzymatyczne wymusza się przez ciśnieniowy przepływ substratu przez membrany i odbiór produktów po jej przeciwnej stronie.

Membrany powinny być hydrofilowe dla łatwej wymiany substratów i produktów oraz mechanicznie wytrzymałe i dobrze znoszące różnice ciśnień.

Najczęściej nylonowe, silikonowe, liposomowe - polimery tworzone najczęściej podczas polimeryzacji lub polikondensacji monomerów na granicy fazy organicznej i wodnej zawierającej enzym (złożone z chlorku poliwinylu, polipropylenu).

Wielkość kapsułek 10-100 μm

Wielkość porów membran 1-100 nm

KAPSUŁKOWANIE I MIKROKAPSUŁKOWANIE - ETAPY:

• enzym miesza się z hydrofilowym monomerem w wodzie i dodaje się niemieszający się z wodą rozpuszczalnik => powstaje EMULSJA,

• do emulsji dodaje się rozpuszczalnik z hydrofobowym monomerem, miesza się,

• na granicy (w interfazie) fazy organicznej i wodnej te dwa monomery polimeryzują (membrana powstaje na granicy faz) => membrana zamyka się, tworząc kapsułkę,

• zamknięcie enzymu w wodnym roztworze w kapsule.

ZASTOSOWANIE - farmacja, kontrola jakości żywności, metoda wymaga wypełniaczy utrzymujących kształt kapsułki (żelatyny, albuminy).

METODY CHEMICZNE

1. IMMOBILIZACJA PRZEZ TWORZENIE WIĄZAŃ KOWALENCYJNYCH

• najczęściej stosowana w przemyśle spożywczym => najtrwalsze unieruchomienie enzymów,

• wiązanie enzymu z nośnikiem dzięki tworzeniu wiązań kowalencyjnych: peptydowych, estrowych, C-C, N-C, O-C i innych pomiędzy grupami czynnymi nośników a grupami funkcyjnymi enzymów (-NH₂, -COOH, -SH, -OH).

Wiązanie enzymu z nośnikiem może być wynikiem bezpośredniego wiązania (grupy -OH chityny, celulozy, chitozan również -NH₂ wykorzystywane do tworzenia wiązań kowalencyjnych z enzymem) lub poprzez łączenie z nośnikiem najpierw ligandu (grupy funkcyjne, które mogą tworzyć wiązania kowalencyjne z enzymem) i dopiero do ligandu przyłącza się enzym.

Immobilizację tą metodą należy dobrać w taki sposób, aby łączenie enzymu z nośnikiem nie występowało w miejscu aktywnym enzymu.

Dlatego też immobilizację często przeprowadza się w obecności analogów substratów lub inhibitorów - ochrona miejsca aktywnego (grup aktywnych centrum aktywnego) przed wiązaniem z nośnikiem.

NOŚNIKI: karboksymetyloceluloza (CM-celuloza)

szkło porowate

silikażel

LIGANDY: dwufunkcyjne (co najmniej 2 grupy reaktywne - z jednej przyłączają się do nośnika, z drugiej przyłączają enzym) związki, najczęściej aldehyd glutarowy karbodiimid, kwasy dikarboksylowe, bromocyjan, izomocznik, diaminy.

2. UNIERUCHAMIANIE BEZ MAKROSKOPOWEGO NOŚNIKA MECHANICZNEGO

1. sieciowanie przestrzenne związkami wielofunkcyjnymi

2. sieciowanie kryształów i agregatów białek enzymatycznych

Enzym pełni rolę matrycy i biokatalizatora!!!

Ad a) Sieciowanie związkami wielofunkcyjnymi

Polega na łączeniu cząsteczek enzymu za pośrednictwem czynników sieciujących, jakimi są związki wielofunkcyjne, tj. aldehyd glutarowy, diazobenzydyna, diizocjaniany, diimidoetery, diaminy, bromocyjany, izomocznik.

Sieciowanie enzymu przy użyciu aldehydu glutarowego

Czynniki sieciujące oddziałują głównie z grupami aminowymi na powierzchni enzymu.

W tej metodzie cząsteczki substratu mają łatwy dostęp do enzymu.

Proces łatwy, tani, zapewnia dużą stabilność enzymu, jednak podstawową wadą jest niska stabilność mechaniczna - dlatego sieciowanie jest raczej stosowane jako proces wspomagający inne rodzaje immobilizacji - jako pojedyncza metoda stosowana bardzo rzadko.

Np. trypsyna zaadsorbowana na krzemionce, a następnie utrwalona poprzez międzycząsteczkowe usieciowanie przy użyciu aldehydu glutarowego.

KLASYCZNE TYPY REAKTORÓW CHEMICZNYCH

- urządzenia/zbiorniki, w których zachodzi reakcja, wykorzystywane do procesu unieruchamiania.

1. Reaktor zbiornikowy z ciągłym mieszaniem

Do zbiornika wprowadza się nośnik z unieruchomionym enzymem. Następnie wprowadza się substrat, zachodzi reakcja, po czym usuwa się produkty reakcji.

Szybkość reakcji zależy od szybkości mieszania, ale trzeba uważać, bo mieszanie może uszkodzić nośnik.

Tryb pracy:

• okresowy tryb pracy (o trybie pracy zamkniętym) - substrat wprowadza się przed reakcją, produkt usuwa się po zakończeniu reakcji; reakcję prowadzi się do czasu uzyskania satysfakcjonującego poziomu produktu,

• ciągły tryb pracy (o trybie pracy przepływowym) - substraty w sposób ciągły dostarczane do układu, a produkty w sposób ciągły usuwane z układu.

2. Reaktor ze złożem fluidalnym

Substrat przepływa przez złoże z unieruchomionym enzymem w górę reaktora z szybkością dostateczną do powiększenia objętości złoża i fluidyzacji cząsteczek (mieszanina cząsteczek nośnika z enzymem zachowuje się jak ciecz - substrat recyrkuluje z cząsteczkami ciała stałego nośnika i enzymu kilkakrotnie).

3. Reaktor typu kolumny przepływowej z upakowanym złożem

Wyższa sprawność od reaktorów zbiornikowych, najczęściej stosowany.

Substrat przepływa przez upakowane złoże z góry w dół tylko jeden raz - regulując szybkość przepływu substratu przez złoże, regulujemy ilość powstającego produktu.

PRZEMYSŁOWE ZASTOSOWANIE UNIERUCHOMIONYCH ENZYMÓW

Enzym	Zastosowanie
izomeraza glukozowa glukoamylaza lipaza inwertaza termolizyna pektynazy: endopoligalakturonaza pektynometyloesteraza β-D-galaktozydaza reduktaza diacetylowa	produkcja syropu fruktozowego ze skrobi kukurydzianej hydroliza maltodekstryn przetwórstwo skrobi hydroliza oleju (produkcja tłuszczów jadalnych) produkcja cukru inwertowanego produkcja aspartamu hydroliza pektyn - klarowanie i ekstrakcja soków, maceracja miazgi ze świeżych jabłek przed tłoczeniem hydroliza laktozy w mleku i serwatce produkcja piwa

Pomimo prób zastosowania unieruchomionych enzymów proteolitycznych i amylolitycznych (wyjątek glukoamylaza) w gałęziach przemysłu spożywczego, nie udało się ich stosować na skalę przemysłową.

IZOMERAZA GLUKOZOWA - przypomnieć!!!

GLUKOAMYLAZA - hydroliza wiązań glikozydowych maltodekstryn, skrobi, głównie wiązania β-1,6-glikozydowe (rozgałęzienia skrobi) i α-1,4-glikozydowe.

LIPAZY - hydroliza oleju (produkcja tłuszczów jadalnych), przeprowadzają częściową hydrolizę tłuszczów właściwych.

W przemyśle przetwórczym wykorzystuje się kwasy tłuszczowe (szczególnie krótkołańcuchowe) uwalniane podczas hydrolizy => charakterystyczny smak i zapach.

Mleczarstwo - szybsze dojrzewanie serów

Cukiernictwo - lipolityczne właściwości (poprawa czekolady, cukierki).

INWERTAZA (sacharaza, β-fruktofuranozydaza) - hydrolaza

TERMOLIZYNA - hydrolza

• termostabilna metaloendoproteina (endoproteinaza) (Zn, Ca) z Bacillus thermoproteolyticus,

• preferuje hydrolizę wiązań peptydowych Aa/Leu, Aa,Phe,

• katalizuje też syntezę wiązań peptydowych na drodze kondensacji hydrolitycznej,

• w większości przypadków reakcje katalizowane przez enzym są ODWRACALNE (synteza wiązań peptydowych).

Aspartam - zmetylowany dipeptyd

N-(benzyloksykarbonylo)-L-asparagininan (zablokowana gr. NH₂)

+

ester metylowy L-fenyloalaniny (zablokowana gr. COOH)

termolizyna

ester metylowy N-(benzyloksykarbonylo)-L-aspartylo-L-phenyloalaniny

ester metylowy L-aspartylo-L-fenyloalaniny

R - butylo (C₄)

oktylo (C₈)

oktadecylo (C₁₈) - silany

NOŚNIKI STOSOWANE W IMMOBILIZACJI

ROZPUSZCZALNE

rozpuszczalny dekstran, alkohol poliwinylowy

NIEROZPUSZCZALNE

ORGANICZNE

NIEORGANICZNE

• krzemionka i jej formy wodorotlenkowe, tj. szkło ceramiczne, piasek,

• ziemia okrzemkowa,

• glin, tytan w formie tlenków,

• cyrkon i jego formy wodorotlenkowe,

• hydroksyapatyt.

SYNTETYCZNE

• poliakrylamid,

• silikony,

• żywice epoksydowe,

• żywice jonowymienne,

• poliuretan,

• polipropylen,

• poliester.

NATURALNE

• agar,

• alginian,

• karagenian,

• pochodne celulozy,

• dekstran,

• chitozan,

• albumina,

• kolagen,

• żelatyna,

• pektyna,

• skrobia.

NOŚNIKI:

• heteropolisacharydy - agaroza, alginian, karagenian,

• kolagen,

• poliakrylamid, polistyren,

• żywice sieciowane energią świetlną.

NOŚNIKI:

celuloza, tlenek glinu, krzemionka (SiO₂), szkło porowate, ziemia okrzemkowa, węgiel aktywny

oraz wymieniacze jonowe:

• anionity o ładunku „+” - DEAE-celuloza, chitozan,

• kationity o ładunku „-” - CM-celuloza.

---