WD-9 29.04.2009

Reakcje katalizowane przez transglutaminazę- sieciowanie łańcuchów polipeptydowych.

Transglutaminaza

-występuje w krwi ssaków, uczestniczy w wytwarzaniu skrzepów

-produkowana także przez drobnoustroje

-jako acylotransferaza, katalizuje reakcje łączenia reszty acylowej glutaminy wbudowywanej w białko lub w peptyd z pierwszorzędową grupą aminową aminokwasu wolnego lub wbudowanego w białko lub peptyd (lizyna).

O O

|| ||

białko₁-(CH₂)₂-C-NH₂ + H₂N-(CH₂)₄-białko₂ białko₁-(CH₂)₂-C-N-(CH₂)₄-białko₂ + NH₃

|

H

O O

|| ||

białko-(CH₂)₂-C-NH₂ + H₂NR białko-(CH₂)₂-C-N-R + NH₃

wolny |

aminokwas H

Wiązanie izopeptydowe- powstaje pomiędzy grupami nie leżącymi w pozycji α- może:

• łączyć dwa białka,

• łączyć (sieciować) jedno białko,

• może także wiązać aminokwas- lizynę.

Reakcja ma zastosowanie w:

-wzbogaceniu diet w lizynę

-wspomaganiu żelowania białek w farszach węd linowych i galaretkach rybnych, do wiązania kawałków mięsa i ryby

-produkcja zamienników tłuszczu

-pozwala łączyć odpadowe surowce białkowe

Jedynym producentem enzymatycznych preparatów amylolitycznych, pektynolitycznych i proteolitycznych w Polsce są Zakłady Przemysłu Ococowo-Warzywnego PEKTOWIN w Jaśle.

1. PROTEOPOL BP-S jest preparatem enzymatycznym zawierającym enzymy proteolityczne, otrzymywane w procesie biosyntezy z wykorzystaniem szczepu bakterii Bacillus subtilis. Enzymy te hydrolizują białka do polipeptydów, peptydów i aminokwasów w środowiskach o odczynie zbliżonym do obojętnego.

ZASTOSOWANIE

• Produkcja pieczywa cukierniczego - częściowa biodegradacja glutenu mąki przy wyrobie kruchych ciast cukierniczych (krakersy, wafle). Preparat umożliwia otrzymanie jednorodnej, kruchej, lekko łamliwej konsystencji wypieku.

• Produkcja piwa - uzupełnienie enzymów proteolitycznych słodu lub ich częściowe zastąpienie przy przerobie zbożowych surowców niesłodowanych.

DOZOWANIE

• W procesie produkcji krakersów, herbatników i wafli preparat dodaje się w fazie zarobu ciasta. Zaleca się dawkę 0,4 - 0,6 kg PROTEOPOLU BP-S-100 na tonę gotowego wyrobu. Maksymalna dopuszczalna dawka - 2,0 kg.

• Przy produkcji piwa preparat stosowany jest w procesie przygotowania brzeczki. Maksymalna dawka PROTEOPOLU BP-S-100 wynosi 0,1% w stosunku do surowca niesłodowanego.

2. PROTEOPOL BP-T jest preparatem enzymatycznym zawierającym enzymy proteolityczne, otrzymywane w procesie biosyntezy z wykorzystaniem szczepu bakterii Bacillus subtilis.
   Enzymy te hydrolizują białka do polipeptydów, peptydów i aminokwasów w środowiskach o odczynie zbliżonym do obojętnego.

ZASTOSOWANIE

• Przemysł skórzany - depilacja i uszlachetnianie skór świńskich.

• Przemysł fotochemiczny - rozkład żelatyny w procesach odzyskiwania srebra z odpadów materiałów fotograficznych.

3. PROTEOPOL FP-T jest preparatem enzymatycznym zawierającym enzymy proteolityczne, otrzymywane w procesie biosyntezy z wykorzystaniem szczepu Aspergillus niger. 
   Enzymy te hydrolizują białka do polipeptydów, peptydów i aminokwasów w środowiskach o odczynie kwaśnym. Preparat zawiera enzymy towarzyszące działające na substancje organiczne. 

ZASTOSOWANIE

• Preparat stosowany jest głównie w przemyśle futrzarskim w technologii wytrawiania skór.

• Poprawa jakości skóry poprzez zwiększenie jej pulchności i ciągliwości. Skrócenie czasu trwania procesu.

AMYLAZY

-rodzina enzymów hydrolizująca wiązania glikozydowe skrobi

-używanie do hydrolizy nierozpuszczalnej w zimnej wodzie skrobi na rozpuszczalne dekstryny i cukry prostsze.

Skrobia- roślinna substancja zapasowa zbudowana z :

-amylozy- nierozgałęziony polimer reszt α-D-glukozy połączonych wiązaniami α-1,4-glikozydowymi

-amylopektyny- rozgałęziony polimer reszt α-D-glukozy, w którym większość reszt glukozy połączona jest wiązaniami α-1,4-glikozydowymi, ale co 25-30 reszt występują wiązania α-1,6-glikozydowe, tworząc punkt rozgałęzień.

Mechanizm działania poszczególnych amylaz na fragment cząsteczki skrobi.

Do grupy amylaz należą:

-α-amylaza

-β-amylaza

-glukoamylaza

-pullulanaza

-izoamylaza

-α-D-glukozydaza

-transferaza glukozowa cyklodekstryn

α-amylaza, β-amylaza, glukoamylaza wraz z pullulanazą i izoamylazą mają największe znaczenie przemysłowe.

Enzymatyczna hydroliza skrobi- etapy

• Przygotowanie skrobi natywnej do hydrolizy poprzez kleikowanie (105°C, 5 min)

Kleikowanie- przygotowanie natywnej, nierozpuszczalnej skrobi do hydrolizy enzymatycznej, najczęściej w skutek ogrzewania. Skrobia pęcznieje, wchłania wodę, traci strukturę ziarnistą- tworzy się lepki roztwór koloidalny.

• Etapy produkcji hydrolizatów skrobiowch:

1. Faza dekstrynowania, upłynniania- ma miejsce degradacja skrobi do krótszych łańcuchów- prowadząc do powstania wysoko- (10-13 reszt glukozy) i nisko- (6-7 reszt glukozy) cząsteczkowych dekstryn. Następuje szybki spadek lepkości roztworu. Najwydajniej zachodzi w temperaturze 60-70°C lub wyższej, jeśli pozwala na to termo stabilność enzymów.

2. Faza scukrzania- dekstryny rozkładane do cukrów prostych: maltoza, maltotrioza, glukoza. Optymalna temperatura tego procesu to 45-50°C.

Z technologicznego punktu widzenia rozróżniamy

1. amylazy upłynniające- α-amylazy, izoamylazy, pullulanazy (głównie termo stabilna α-amylaza z Bacillus licheniformis oraz Bacillus amyloliquefaciens- które mogą przeprowadzać reakcję w temperaturze 90-100°C.

2. amylazy scukrzające- niektóre α-amylazy, β-amylazy, glukoamylazy (głównie glukoamylaza i α-amylazy grzybowe)

Klasyfikacja hydrolizatów skrobiowych

Enzymatyczne hydrolizaty skrobiowe (produkty enzymatycznego rozkładu skrobi) o różnym stopniu depolaryzacji skrobi.

Najczęściej stosowany miernik przeprowadzanej hydrolizy jest równoważnik glukozowy DE.

Równoważnik glukozowy DE (dextrose equivalent)- określa procentową zawartość cukrów redukujących, wyrażonych jako glukoza, w przeliczeniu na suchą masę hydrolizatu.

Nazwa produktu	Stopień scukrzenia DE
Glukoza krystaliczna	100
Syropy glukozowe	96-98
Syropy skrobiowe: -wysokoscukrzony -średnioscukrzony -niskoscukrzony	50-65 35-50 30-35
Maltodekstryny	5-25

Schemat działania α-amylaz na cząsteczkę skrobi

skrobia dekstryny, oligosacharydy, maltoza, glukoza

α-amylaza

-endoamylaza, enzym upłynniający skrobię

-enzym rozkładający w sposób przypadkowy wiązania α-1,4-glikozydowe wewnątrz cząsteczki skrobi (omija wiązania α-1,6-glikozydowe)

-produktami długotrwałej hydrolizy skrobi mogą być w zależności od pochodzenia enzymu: maltotrioza, maltoza, glukoza oraz tzw. dekstryna graniczna składająca się z kilku reszt glukozy

-procesowi hydrolizy towarzyszy bardzo powolny wzrost redukcyjności roztworu, ponieważ spada lepkość roztworu bo powstaje początkowo wysokocząsteczkowe dekstryny następnie niskocząsteczkowe dekstryny i w końcu cukry proste.

Źródła α-amylaz

Źródło	Wew. kom. (I) Zew. kom. (E)	Skala produkcji	Główne zastosowanie
Słód	I	> 100 t/rok	Browarnictwo
Bacillus	E	> 100 t/rok	Przetwórstwo skrobi (hydrolizaty skrobiowe)
Aspergillus	E	> 10 t/rok	Piekarnictwo

Słód jęczmienny

-głównie dla przemysłu piwowarskiego

Zawartość amylaz w suchych i kiełkujących ziarnach jęczmienia

amylaza	Suche ziarno (j.a.- jednostki aktywności)	Po 7-dniach kiełkowania (j.a.)	Wysuszony słód (j.a.)
β-amylaza	3,71	6,94	4,35
Glukoamylaza	1,34	34,8	12,2
Oligo-1,6-glukozydaza	9,2	63,1	28,9
α-amylaza	śladowe	271,2	159,6

α-amylazy pochodzenia mikrobiologicznego

Bakterie: Bacillus Licheniformis, Bacillus amyloliquefeciens, Bacillus subtilis

Grzyby strzępkowe: Aspergillus oryzae, Aspergillus niger

Właściwości wybranych α-amylaz

Źródło	M. cz. [kDa]	Optymalne pH	Optymalna temperatura °C
Aspergillus oryzae	52,6	5,5-5,9	40-50
Aspergillus niger	61,0	5,0-6,0	35
Aspergillus niger	58,0	4,0-5,0	50
Bacillus subtilis	48,0	6,0-7,0	60
Bacillus licheniformis	63,0	5,0-10,0	90
Bacillus licheniformis	22,0	5,0-8,0	76
Słód jęczmienny lub pszenny	45,0	4,7-5,5	50-65

- α-amylaza głównie wykorzystywana do upłynniania skrobi, powoduje bardzo szybkie upłynnianie skrobi, ale też bardzo powolne scukrzanie, gdyż wykazuje niskie powinowactwo do kilku cukrów

-Niska termo stabilność grzybowych α-amylaz wykorzystywana jest w piekarnictwie.

-α-amylazy bakteryjne charakteryzują się wyższym optimum pH i temperatury oraz wyższą termo stabilnością w porównaniu z grzybowymi słodowymi.

-Do przemysłowego upłynniania skrobi stosuje się termo stabilną α-amylazę Bacillus licheniformis oraz Bacillus amyloliquafaciens (może przeprowadzać reakcję w temperaturze 90-105°C. Maksymalne DE 30, średnio 8-12).

Produkty hydrolizy skrobi- zależne od pochodzenia enzymu i parametrów hydrolizy

Źródło	Produkty hydrolizy skrobi
Bacillus subtilis	α-dekstryny, maltoheksoza, maltopentoza, glukoza 4-5%
Bacillus licheniformis	α-dekstryny, maltoza, maltotrioza, maltopentoza, glukoza 8-10%
Aspergillus oryzae, A. niger	α-dekstryny, dużo maltozy oraz maltotrioza

Scgemat działania β-amylaz na cząsteczkę skrobi

skrobia dekstryna graniczna i maltoza

β-amylaza

-egozamylaza, amylaza scukrzająca

-rozkłada co drugie wiązanie α-1,4-glikozydowe od końca nieredukującego łańcucha skrobiowego, odrywając jednostki β-maltozy

-produktami są: wysokocząsteczkowa dekstryna graniczna i β-maltoza

-nie jest w stanie ominąć wiązań α-1,6-glikozydowych jak α-amylaza

-w wyniku hydrolizy skrobi β-amylazy następuje przyrost redukcyjności roztworu- bo powstaje maltoza- cukier redukujący, nie towarzyszy temu spadek lepkości roztworu.

Źródła β-amylaz

Źródło	Wew. kom. (I) Zew. kom. (E)	Skala produkcji	Główne zastosowanie
Słód jęczmienny	I	> 100 t/rok	Browarnictwo
Bacillus	E	> 1 t/rok	Przetwórstwo skrobi (hydrolizaty skrobiowe)

Głównym źródłem tego enzymu są dojrzałe lub kiełkujące ziarna jęczmienia, przenicy, soji. Znane są jednak także bakteryjne źródła β-amylazy.

Właściwości wybranych β-amylaz

Źródło	M. cz. [kDa]	Optymalne pH	Optymalna temperatura °C
Bacillus cereus	35,0	7,0	50
Bacillus polimyxa	59,0	6,8	37
Bacillus megaterium	35,0	6,0	50
Roślinne	47,5-64,2	4,0-5,5	40-55

β-amylaza z bulw bataty, topinamburu aktywna w 60-80°C, stąd bulwy niektórych gatunków tej rośliny po ugotowaniu mają słodki smak.

Schemat działania glukoamylaz na cząsteczkę skrobi

skrobiadekstryna i glukoza

glukoamylaza

-egzoamylaza, główny enzym scukrzający w przetwórstwie

-hydrolizuje wiązania α-1,4-glikozydowe od końca nieredukującego łańcucha skrobi, odszczepiając cząsteczki β-glukozy

-może też hydrolizować wiązania α-1,6-glikozydowe ale z 20-30 x mniejszą wydajnością

-powoduje bardzo powolny spadek lepkości roztworu, szybki przyrost redukcyjności

Źródła glukoamylaz

Glukoamylaza występuje w słodzie, ale w małych ilościach, dla celów przemysłowych źródłem są grzyby niższe głównie z rodzaju Aspergillus, Rhizopus, Endomyces, Endomycopsis

Źródło	Wew. kom. (I) Zew. kom. (E)	Skala produkcji	Główne zastosowanie
Aspegillus	E	> 100 t/rok	Przetwórstwo skrobi (scukrzanie)

Właściwości wybranych glukoamylaz

Źródło	Optymalne pH	Optymalna temperatura °C
Aspergillus awamori	4,6	65
Aspergillus niger	5,5	60
Endomycopsis capsularis	5,6	55
Rhizopus delemar	4,0-5,0	40-50
Roślinne	4,0-5,0	55

Glukoamylaza charakteryzuje się dużą odpornością na zmiany pH (stabilność w zakresie 1,8-8,8 dla enzymów z Aspergillus Niger oraz 1,8-10,5 z Aspergillus awamori)

Pullulanoza i izoamylaza

-są to endoamylazy

-enzymy znoszące rozgałęzienia, gdyż hydrolizują one wiązania α-1,6-glikozydowe

-pullulanaza działa na oligosacharydy zawierające jedynie dwie jednostki glukozy z każdej strony wiązania α-1,6-glikozydowego

-izoamylaza wymaga obecności co najmniej trzech jednostek glukozy z każdej strony wiązania α-1,6-glikozydowego do swego działania

-izoamylazę otrzymuje się z bakterii Cytophaga, Bacillus, Escherichia i drożdży Lipomyces

-Pullulanazę otrzymuje się z bakterii Klebsiella, Escherichia, Bacillus, Streptococus. Chociaż enzym ten zidentyfikowano w takich roślinach jak: bawełna, ryż i szpinak to jednak w celach przemysłowych izoluje się go głównie ze szczepów bakterii.

Gorzelnictwo i browarnictwo

-w browarach w procesie zacierania słodu (hydrolizy brzeczki piwnej), czyli przygotowania go do fermentacji przez drożdże upłynnianie i scukrzanie skrobi, zwiększa zawartość cukrów fermentowanych przez drożdże produkcja piwa

-w gorzelnictwie do upłynniania skrobi przy produkcji spirytusu z surowców niesłodowych, ale zawierających duże ilości skrobi: kukurydza, pszenica, ziemniaki, maniok

-do klarowania piwa-rozpad skrobi ułatwia klarowanie

Fermentacja alkoholowa- przekształcenie glukozy w etanol

COOH H +NADH+H OH

Glikoliza | -CO₂ | - NAD |

Glukoza C=O C=O CH2

| 1 | 2 |

CH₃ CH₃ CH₃

kw. pirogronowy aldehyd octowy alkohol etylowy

1 Dekarboksylaza pirogronianowa, DTT, Mg²⁺

2 Dehydrogenaza alkoholowa

---