ENZYMOLOGIA

wykład 6

25.03.2009r.

Chromatografia sita molekularnego c.d.

• filtracja żelowa/ sączenie molekularne/ chromatografia rozdzielcza

• rozdział na podstawie różnic w wielkości i kształcie cząsteczek

Białka ulegają rozdziałowi między 2 fazy płynne:

• faza ruchoma (płyn na zewnątrz ziaren żelu)

• faza stacjonarna (płyn zalegający wewnątrz ziaren żelu)

• fazę ruchomą i stacjonarną stanowi ten sam roztwór.

Upakowane złoże żelu można matematycznie opisać:

V_t = V₀ + V_i + V_p

V_t = objętość całkowita złoża w chromatografii sita molekularnego

V₀ = objętość zerowa - objętość fazy ruchomej (przestrzeni między ziarnami żelu)

V_i = objętość wewnątrz złoża (objętość fazy stacjonarnej - wewnątrz granulek żelu)

V_p = objętość polimeru (żelu, nośnika) - objętość wypełnienia przez substancję żelową

V₀ wyznacza się najczęściej za pomocą barwnika - błękit bromofenolowy

• cząsteczki tego barwnika są na tyle duże, że nie wnikają w pory żelu i wędrują razem z czołem rozpuszczalnika

• wyznacznik objętości wewnątrz żelu - z nim będą wędrować białka niewnikające w pory

V_E - objętość elucyjna (w której pojawia się dane białko)

• dla białek niewnikających w pory żelu V_E = V₀

Współczynnik podziału

• określa zachowanie się danej cząsteczki podczas rozdziału:

- dla cząsteczek niewnikających do wnętrza granulek: V_E = V₀ to K_d = 0

- dla cząsteczek selektywnie zatrzymywanych: 0 < K_d ≤ 1

- dla cząsteczek swobodnie dyfundujących do wnętrza granulek żelu: V_E = V_t oraz K_d = 1

Żele:

• usieciowane hydrofilowe żele składające się z regularnie porowatych żeli upakowanych w kolumnę

• są one usieciowanymi polimerami, które po uwodnieniu pęcznieją, tworząc żel => po napęcznieniu formuje się ze w kolumnę

3 rodzaje żeli - w chromatografii żelowej tworzą żele, a w innych rodzajach chromatografii wykorzystywane są jako nośniki:

1. żele dekstranowe

2. żele poliakryloamidowe

3. żele agarozowe

Ad1) Żel dekstranowy - gł. Sephadex

Dekstran

• polisacharyd zbudowany z monomerów glukozy połączonych wiązaniami α-1,6-glikozydowymi w prostym łańcuchu,

• rozgałęzienia tworzone przez wiązania α-1,4-glikozydowe lub 1,3-glikozydowe,

• naturalny polimer - produkowany przez bakterie Leuconostoc mesenteroides.

Żele dekstranowe:

• zbudowane z łańcuchów dekstranu, połączonych ze sobą mostkami poprzecznymi z epichlorohydryny

• od liczby tych mostków zależy stopień usieciowania żelu (im więcej mostków, tym większy stopień usieciowania, mniejsze pory), a w konsekwencji zdolność rozdzielcza

• nierozpuszczalne w roztworach wodnych

• dość duża odporność chemiczna

• stabilność w pH = 2÷12

• dość szeroka zdolność rozdzielcza białek (szeroki zakres frakcjonowania) - możliwość rozdziału białek o masie od 100 - 600 000 Da

Ad2) Żel agarozowy - gł. Sepharose

Agaroza - jest polimerem zbudowanym z powtarzających się reszt D-galaktozy i 3,6-dehydrogalaktozy, połączonych wiązaniem 1,3 i 1,4-glikozydowym (naturalny polimer, składnik agaru).

Po rozpuszczeniu w wysokich temperaturach w wodzie i ochłodzeniu do niższych temperatur agaroza spontanicznie/ samoistnie ulega usieciowaniu.

Struktura stabilizowana jest wiązaniami wodorowymi.

~100°C - płynne monomery

~40°C - polimery (postać usieciowana)

Żele agarozowe:

• przeznaczone do frakcjonowania białek o dużej masie - od 40 000 kDa - pory dość duże

• sztywne, ale termowrażliwe (>45°C => postać płynna)

• mniejsza zdolność rozdzielcza, mniejsza stabilność chemiczna niż pozostałe rodzaje żelu

• stabilne przy pH = 5÷9

• wielkość porów zależy od stężenia % agarozy

Ad3) Żel poliakryloamidowy - gł. Bio-Gel P

• syntetyczny polimer monomerów akryloamidu i N,N'-metylenobisakrylamidu,

• inicjatorem kopolimeryzacji jest nadsiarczan amonu a katalizatorem Temed (N,N,N,N'-tetrametylo-etylenodiamina).

Za usieciowanie tego żelu odpowiedzialny jest metylenobisakryloamid.

• stopień usieciowania zależy od stężenia akryloamidu i metylenobisakryloamidu oraz od wzajemnych proporcji tych dwóch polimerów (wyższe stężenie, więcej formy metylenobis => wyższy stopień usieciowania, mniejsze pory)

Cechy żeli akryloamidowych:

• bierne chemicznie

• charakteryzują się dość dużą wytrzymałością mechaniczną i termiczną

• regulując stężenia polimerów możemy precyzyjnie regulować wielkość porów

• ALE TOKSYCZNY!!! - akryloamid w formie proszku jest neurotoksyną!

• stabilne przy pH = 1÷10

• oporne na wysokie stężenia związków denaturujących

• nie poddają się działaniu drobnoustrojów

• do rozdziału białek o małej masie do 400 kDa

Zakresy frakcjonowania

Name	Type	Fractionation Range (kD)
Sephadex G-10 Sephadex G-25 Sephadex G-50 Sephadex G-100 Sephadex G-200 Bio-Gel P-2 Bio-Gel P-6 Bio-Gel P-10 Bio-Gel P-30 Bio-Gel P-100 Bio-Gel P-300 Sepharose 6B Sepharose 4B Sepharose 2B Bio-Gel A-5 Bio-Gel A-50 Bio-Gel A-150	Dextran Dextran Dextran Dextran Dextran Polyacrylamide Polyacrylamide Polyacrylamide Polyacrylamide Polyacrylamide Polyacrylamide Agarose Agarose Agarose Agarose Agarose Agarose	0,05-0,7 1-5 1-30 4-150 5-600 0,1-1,8 1-6 1,5-20 2,4-40 5-100 60-400 10-4000 60-20000 70-40000 10-5000 100-50000 1000-150000

Chromatografia jonowymienna

Białka rozdzielają się w oparciu o różnice ich wypadkowych ładunków.

Zasada metody polega na wymianie jonów z roztworu na jony o tym samym ładunku w nośniku.

Faza nieruchoma - jonit

Faza ruchoma - ciecz (roztwór elektrolitu)

JONIT (wymieniacz jonowy) - nośnik, nierozpuszczalny polimer, wraz ze związanymi do niego grupami jonowymi (zdolnymi do dysocjacji);

Najczęściej:

• celuloza

• żele agarozowe

• żele dekstranowe

• szklane kulki, polistyren

W zależności od rodzaju zdolnych do dysocjacji grup funkcyjnych jonity dzielimy na kationity i anionity.

Kationit - wielkocząsteczkowy, wielowartościowy anion (wielokwasy), z którym są związane małocząsteczkowe kationy, zdolne do wymiany.

Wymianę jonów na kationicie można przedstawić następująco:

R-COO^-H⁺ + B⁺A^- <-> R-COO^-B⁺ + H⁺A^-

Anionit - wielkocząsteczkowy, wielowartościowy kation (wielozasada), z którym są związane małocząsteczkowe aniony, zdolne do wymiany

Najczęściej stosowaną grupą czynną:

• anionitów jest dietyloamina (dietyloaminoetylo-, DEAE, III-rz amina),

• kationitów jest grupa karboksylowa (karboksylometylo-, CM).

DEAE:R = ―CH₂―CH₂―NH(CH₂CH₃)₂

CM:R = ―CH₂―COO^-

Jony ruchliwe mogą być wymieniane z jonami z roztworu, natomiast pozostała część (podstawa) pozostaje nieruchoma.

Kationity - wiążą białka o wypadkowym ładunku dodatnim, czyli gdy pH buforu > pI białka

Anionity - wiążą białka o wypadkowym ładunku ujemnym, czyli gdy pH buforu < pI białka

Chromatografia jonowymienna - ETAPY

1. Przygotowanie jonitu do wymiany jonowej - pęcznienie i jonizacja jonitu (dysocjacja - rozpuszczenie jonitu w roztworze umożliwiającym dysocjację):

kationit-COOH -> [kationit-COO]^- + H⁺

2. Równoważenie kolumny roztworem elektrolitu, w którym będzie prowadzony rozdział (np. NaCl) -> wymiana kationitów (powstaje zdysocjowany kationit, który przygotowany jest do wymiany - H⁺ przechodzi do roztworu, w jego miejsce wchodzi Na⁺):

[kationit-COO]^- H⁺ + Na⁺ + Cl^- -> [kationit-COO]^- Na⁺ + H⁺ + Cl^-

3. Nanosimy na (zrównoważoną) kolumnę białka w buforze do równoważenia -> białka wypadkowym ładunku ujemnym wypłyną razem z czołem rozpuszczalnika, natomiast białka o wypadkowym ładunku dodatnim będą się wymieniały z Na⁺ na jonicie i jonit będzie wiązał te białka wiązaniami jonowymi (z różną siłą). Im większa różnica ładunków między białkiem a jonitem tym silniej białko jest wiązane.

[kationit-COO]^- Na⁺ + białko⁺ -> [kationit-COO]^- białko⁺ + Na⁺

4. Elucja białek związanych z jonowymieniaczem poprzez:

• zastosowanie czynników konkurujących z białkiem o miejsce na jonowymieniaczu - roztworami soli (np. NaCl) o wzrastającym stężeniu -> zwiększenie siły jonowej

• zmianę ładunku białek, czyli zmianę pH środowiska (elucja z kationitu podwyższenie pH)

[kationit-COO]^- białko⁺ + Na⁺ Cl^- -> [kationit-COO]^- Na⁺ + białko⁺

[Im białko było silniej związane z jonitem, tym wyższe stężenie soli potrzebne do jego uwolnienia.]

Chromatografia jonowymienna

Chromatografia hydrofobowa

Rodzaj chromatografii adsorpcyjnej, w której białka wiążą się z fazą stacjonarną za pomocą wiązań hydrofobowych.

Rozdział opiera się o różnice w oddziaływaniach hydrofobowych.

Rozdział białek następuje na podstawie różnic w sile oddziaływań hydrofobowych pomiędzy grupami hydrofobowymi kowalencyjnie związanymi z nośnikiem a obszarami hydrofobowymi rozdzielanych białek.

Właściwości hydrofobowe białek wynikają z obecności aminokwasów hydrofobowych:

[najbardziej hydrofobowy => najmniej hydrofobowy]

tryptofan, izoleucyna, fenyloalanina, tyrozyna, leucyna, walina, metionina, alanina

Oddziaływania hydrofobowe są silniejsze w obecności jonów soli, czyli w środowisku o zwiększonej sile jonowej oraz w podwyższonej temperaturze.

Przy dużym stężeniu soli, w temperaturze pokojowej dochodzi do eksponowania obszarów hydrofobowych białka. Jony soli otaczają się cząsteczkami wody i niszczą otoczkę wodną - zaburzana jest struktura białka, odsłaniane są jego obszary hydrofobowe.

Tzw. szereg Hofmeistera: sole zgodnie z rosnącą zdolnością wysalania białka

(czyli zwiększania oddziaływań hydrofobowych)

Nieco słabsze fosforan i chlorek sodu, pozwalają uzyskać zdecydowanie lepszą selektywność wiązań i elucji cząsteczek białkowych, stąd najczęściej używane.

ETAPY:

Mieszaninę białek nanosi się na kolumnę w solwencie (rozpuszczalniku) o dużej sile jonowej (a). Rozdział polega na różnicowaniu siły oddziaływań hydrofobowych między nośnikiem a rozdzielanymi substancjami - białka, które mają dużo aminokwasów hydrofobowych silniej wiążą się ze złożem (b). Zmniejszając gradientowo siłę jonową eluenta wymywa się z kolumny białka (c), w pierwszej kolejności te o bardzo słabych oddziaływaniach (o małej zawartości aminokwasów hydrofobowych).

Nośniki: usieciowana agaroza (sepharose), syntetyczne polimery silikonowe i akrylamidowe.

Hydrofobowe grupy (ligandy) przyłącza się do nośnika po jego uprzedniej aktywacji epichlorohydryną poprzez wiązanie estrowe.

Najczęściej przyłączanymi grupami hydrofobowymi (ligandami) są: grupa butylowa, grupa fenolowa lub grupa oktylowa (grupy te oddziałują z obszarami/ aminokwasami hydrofobowymi białek).

Nośniki z przyłączonymi grupami hydrofobowymi

[Epichlorohydryna pełni dodatkowo funkcję odstępnika.]

Sposoby elucji zaadsorbowanych na nośniku białek:

1. obniżenie siły jonowej (zmniejszenie stężenia soli)

2. zmiana rodzaju jonów środowiska na jony o mniejszej zdolności wysalającej

3. zastosowanie detergentów (zmniejszenie siły oddziaływań hydrofobowych)

Chromatografia powinowactwa

Szczególny typ chromatografii adsorpcyjnej, w której wykorzystuje się specyficzne powinowactwo dwóch substancji

Rozdział opiera się o różne powinowactwa rozdzielanych substancji do ligandu.

Do złoża, jakim jest upakowany w kolumnie nośnik, dołącza się kowalencyjnie ligandy, które wiążą specyficznie, swoiście oczyszczane białka (1 ligand -> 1 enzym lub grupa enzymów podobnych).

Ligandy:

• analogi substratu (wiążą białka, ale reakcja nie zachodzi!)

• efektory allosteryczne enzymów

• koenzymy

• przeciwciała specyficzne dla danego białka enzymatycznego

Nośniki:

• żele agarozowe, poliakrylamidowe

• celuloza, porowate szkło

Nośniki są bierne chemicznie, należy je chemicznie aktywować.

W przypadku najczęściej stosowanych nośników cukrowych można zaktywować ich grupy ―OH, w reakcji z bromocyjanem lub epichlorohydryną.

Aktywacja nośnika bromocyjanem

Dopiero do zaktywowanego nośnika można przyłączyć ligandy.

Reakcje wiązania ligandu do zaaktywowanego nośnika

Aktywacja nośnika przez CNBr umożliwia przyłączenie ligandów posiadających grupy NH₂

Ligandy białkowe wiążą się z nośnikiem także za pomocą grup COOH, OH, SH.

Schemat procesu chromatografii powinowactwa

1. Aktywacja nośnika i immobilizacja ligandu (gł. wiązaniami kowalencyjnymi)

2. Specyficzne wiązanie enzymu i elucja niezwiązanych cząsteczek (odmycie nieswoiście zaadsorbowanych oraz elucja niezaadsorbowanych cząsteczek poprzez przepłukiwanie złoża)

3. Elucja specyficznie związanego enzymu

Swoistą adsorpcję zastosowano po raz pierwszy już w 1910 r. do izolowania α-amylazy. Ligandem była skrobia, a rozpuszczalnej formy tego wielocukru użyto do elucji enzymu.

Rodzaje elucji:

• specyficzna - wprowadzenie tego samego lub innego ligandu, który konkuruje o E z ligandem na nośniku

• niespecyficzna:

• poprzez zmianę pH środowiska na odległe od optymalnego dla reakcji wiązania enzymu,

• poprzez zwiększenie siły jonowej w kolumnie,

• stosując czynniki ODWRACALNIE DENATURUJĄCE związany enzym.

ZALETY CHROMATOGRAFII POWINOWACTWA:

• wysoka selektywność (tylko enzym nas interesujący) wynikająca z naturalnej specyficzności oddziałujących cząsteczek => znaczne oczyszczanie enzymu + wysoka wydajność,

• pozwala na zatężenie preparatu enzymatycznego => obróbka dużych objętości roztworu nieoczyszczonego.

WADY CHROMATOGRAFII POWINOWACTWA - proces bardzo drogi.

Chromatografia powinowactwa

Chromatografia podziałowa

Rozdział opiera się na różnej rozpuszczalności rozdzielanych białek w dwóch niemieszających się fazach.

Prędkość migracji białka zależy od stopnia och rozpuszczalności w obu tych fazach.

1. Klasyczna chromatografia podziałowa: cieczowo-cieczowa

• Faza stacjonarna i ruchoma to ciecz,

• Faza stacjonarna zostaje osadzona na nieruchomym porowatym, nieruchomym nośniku oddziaływaniami fizycznymi (z tego względu trudności w utrzymaniu fazy stacjonarnej na nośniku),

• Tzw. normalny układ faz: polarna faza stacjonarna, niepolarna faza ruchoma -> białka hydrofilowe będą wolniej wędrować, bo lepiej rozpuszczają się w fazie stacjonarnej (polarnej).

Chromatografia podziałowa z fazą związaną

• Faza stacjonarna jest kowalencyjnie związana z nośnikiem,

• W normalnym układnie faz nie stosowana, bo rozpuszczalniki organiczne niepolarne mogą denaturować białko (heksan, heptan).

mostek epichlorohydryny

stężenie białka

objętość eluentu

▲+

▲-

Aniony: SCN^- < ClO₄^- < NO^3- < Br^- < Cl^- < CH₃COO^- < SO₄^2- < PO₄^3-

Kationy: Ba²⁺ < Ca²⁺ < Mg²⁺ < Li⁺ < Cs⁺ < Na⁺ < K⁺ < Rb⁺ < NH₄⁺

słabe elektrolity mocne elektrolity,

całkowicie zdysocjowane

―O―CH₂―CH―CH₂

O

nośnik

Epoksy-sepharose

(nośnik zaktywowany epichlorohydryną)

oktylo-speharose

―O―CH₂―CH―CH₂―O―

OH

―O―CH₂―CH―CH₂―O―(CH₂)―CH₃

OH

fenylo-speharose

―O―CH₂―CH―CH₂―O―(CH₂)₃―CH₃

OH

butylo-speharose

Nośnik, np. sepharose

odstępnik

epichlorochydryna

wiązanie estrowe

ligand

grupa hydrofobowa

siła adsorpcji białka

zaaktywowany nośnik

N-podstawiona

grupa karbominowa

C = NH + H₂N―R

C = N―R

zaaktywowany nośnik

aktywna

grupa karbominowa

C = NH

―O

―O

―OH

―OH

nośnik

CNBr

―O

―O

―O

―O

H₂O

---