ENZYMOLOGIA

wykład 8

22.04.2009

PEKTYNAZY - hydrolazy

• hydrolizują wiązania glikozydowi w pektynach,

• ułatwiają uwalnianie soków z miazgi, klarowanie soków (usuwanie zmętnień pektynowych),

• pektyny są heteropolisacharydami, składają się głównie z połączonych ze sobą wiązaniami α-1,4- glikozydowymi jednostek kwasu D-galakturonowego, w znacznej części zestryfikowanych gr. metylowymi,

• kwas galakturonowy - powstaje na skutek utleniania α-D-galaktozy, posiada grupę aldehydową przy C1 i karboksylową przy C6.

β-D-galaktozydaza - hydrolaza (usuwanie laktozy z mleka)

Reduktaza diacetylowa (RA) - oksydoreduktaza

Diacetyl + NADH + H⁺ ↔ NAD + Acetoina

Diacetyl (produkcja piwa)

• diketon o nazwie systematycznej 2,3-butandion, zapachu maślanym,

• znajduje się w piwie jako produkt uboczny fermentacji przez drożdże, przy odpowiednim stężeniu wykazuje korzystne właściwości - pozwala dłużej odczuwać w ustach smak piwa,

• w stężeniu większym niż 0,2 mg/l nadaje piwu niekorzystny „maślany posmak”,

• powstaje w wyniku przetwarzania cukrów przez drożdże, czasami bakterie w procesie fermentacji,

• w czasie leżakowania piwa te same drożdże redukują diacetyl do obojętnych smakowo produktów (acetoina, butandiol).

Zastosowanie immobilizowanych komórek mikroorganizmów głównie drożdży:

(nauczyć się 4):

• do zwiększenia wydajności fermentacji alkoholowej trudnych do zhydrolizowania substratów np.: immobilizacja Schizosaccharomyces pombe wraz z izomerazą ksylozy, umożliwiło otrzymanie etanolu z ksylozy,

• immobilizowane w żelu alginianowym komórki Kluyveromyces fragilis zastosowano do hydrolizy laktozy w mleku i przygotowania mleka przeznaczonego dla osób nietolerujących cukier mlekowy,

• do biodegradacji cholesterolu w mleku zastosowano komórki Rhodococcus egni,

• immobilizowane komórki Streptococcus albus i olivaceus - w biosyntezie izomerazy glukozowej,

• immobilizowane Erwinia rhapontici lub Protaminobater rubrum zawierający syntezę izomaltulozy, do produkcji izomaltulozy - cukru znajdującego się w miodzie,

• bakterie z rodzaju Acetobacter zaadsorbowane na powierzchni porowatego nośnika, którym najczęściej są wióry bukowe do produkcji kwasu octowego poprzez utlenianie alkoholu etylowego - pierwsza technologia, w której zastosowano biokatalizator unieruchomiony.

Stosowanie całych komórek eliminuje procesy wyodrębniania i oczyszczania enzymów → obniżenie kosztów produkcji.

Stabilność enzymów w komórce jest wyższa niż enzymów wyizolowanych.

PEPTYDAZY (enzymy proteolityczne, proteazy)

• katalizują hydrolizę wiązań peptydowych w białkach i peptydach (podstawowe zadanie),

• należą do klasy 3 - hydrolaz,

• niektóre z nich katalizują ponadto hydrolizę wiązań estrowych i amidowych oraz reakcję transpeptydacji i transamidacji,

• 
  w odpowiednich warunkach niektóre peptydazy mogą ponadto syntetyzować wiązanie peptydowe.

Ugrupowanie peptydowe

Hydroliza i resynteza wiązania peptydowego

W roztworach wodnych stan równowagi tej reakcji przesunięty jest w stronę hydrolizy. Zmniejszając stężenie wody, np. poprzez dodanie rozpuszczalnika organicznego, równowaga zostaje przesunięta w stronę syntezy wiązań peptydowych na drodze kondensacji hydrolitycznej.

W środowisku wodnym mogą zachodzić reakcje resyntezy wiązań, ale muszą być spełnione odpowiednie warunki (pH, stężenie substratu).

Peptydazy - niska specyficzność substratowa, jednakże charakteryzują się wybiórczością w stosunku do położenia rozkładanego wiązania w łańcuchu polipeptydowym oraz swoistością w stosunku do hydrolizy wiązań pomiędzy określonymi aminokwasami.

Klasyfikacja:

Egzopeptydazy - EC 3.4.11-19 (odcinają 1 lub 2 aminokwasy od końca N lub C)

• aminopeptydazy EC 3.4.11:

odcinające pojedyncze aminokwasy od końca aminowego,

• karboksypeptydazy EC 3.4.16-18:

odcinające pojedyncze aa od końca karboksylowego,

• dipeptydazy EC 3.4.14:

hydrolizują wiązania peptydowe w dwupetydach,

• dwupeptydylo-peptydazy lub tripeptydylo-peptydazy

odszczepiają jednostki dwupetydowe lub tripeptydowe od końca N (EC 3.4.14) lub końca C (EC 3.4.15),

• omega peptydazy EC 3.4.19:

odcinające różnie podstawione reszty aminokwasowe.

Endopeptydazy (proteinazy) - EC 3.4.21-24, EC 3.4.99 (hydrolizują wiązania wewnątrz łańcucha polipeptydowego)

Na podstawie budowy centrum, wrażliwości na inhibitory oraz mechanizm katalizy wyróżniono:

• serynowe EC 3.4.21

seryna oraz histydyna w centrum aktywnym, są hamowane przez DFP

• cysteinowe EC 3.4.22

cysteina i histydyna w centrum aktywnym, wrażliwość na czynniki utleniające, hamowane przez PCMB

• aspartylowe EC 3.4.23

dwie reszty asparaginianu w centrum aktywnym, aktywność przy niskim pH 1.5-5

• metaloproteinazy EC 3.4.24

inhibicja przez EDTA

Endopeptydazy o znaczeniu przemysłowym

Enzym	EC numer	Preferencyjna hydroliza^x
Serynowe proteazy chymotrypsyna trypsyna subtylizyna	3.4.21 3.4.21.1 3.4.21.4 3.4.21.12	Tyr-, Trp-, Phe-, Leu- Arg-, Lys-, Głównie hydrofobowe
Cysteinowe proteazy Katepsyna B* Papaina* Ficyna* Bromalina*	3.4.22 3.4.22.1 3.4.22.2 3.4.22.3 3.4.22.32-33	Arg-Arg-, Lys-, Phe-X- Arg-, Lys-, hydrofobowe-X- Phe-, Tyr- Lys-, Arg-, Phe-, Tyr-
Aspartylowe proteazy Pepsyna Chymozyna#	3.4.23 3.4.23.1 3.4.23.4	Phe-, Tyr-, Leu-, Asp-, Glu- Phe105-Met106 w κ-kazeinie
Metaloproteazy Termolizyna Neutralne proteinazy	3.4.24 3.4.24.27 3.4.24.28	Ile-, Leu-, Val-, Phe-, Leu-, Phe-, i inne

* szeroka specyficzność w stosunku do aminokwasów hydrolizowanego wiązania peptydowego

# specyficzność podobna do pepsyny

x preferencyjna hydroliza:

Aminokwas - wiązanie od grupy karbonylowej (aminokwas dostarczający grupę karbonylową

Aminokwas - Aminokwas wiązanie między dwoma konkretnymi aminokwasami

Egzopeptydazy ważne dla przemysłu spożywczego:

Aminopeptydazy i karboksypeptydazy

• Lactococcus lactis

• Aspergillus sp.

• Rhizopus oryzae

Zastosowanie: usuwanie gorzkiego smaku z hydrolizatów białkowych, także przy produkcji sera.

Otrzymywanie i zastosowanie peptydaz roślinnych

Papaina, bromelina, ficyna - wewnątrzkomórkowe proteazy cysteinowe, optimum pH 5-7

Enzym	Źródło	Skala produkcji	Główne zastosowanie
Papaina	Sok z niedojrzałych owoców papai (Carica papaya)	> 10 t/rok	Kruszenie mięsa, browarnictwo - usuwanie zmętnienia piwa
Bromelina	Sok (lateks) z pnia ananasa	< 1 t/rok	Browarnictwo, kruszenie mięsa
Ficyna	Sok z niektórych odmian drzew figowych gł. Ficus glabrata	< 1 t/rok	Modyfikacja składników żywności

Ficyna - najdroższa, stąd najrzadziej stosowana

Komercyjne otrzymywanie papiny

Zebranie mleczka kauczukowego z niedojrzałych owoców papai

(nacięcie rano, z 1 drzewa 1 l rocznie, mleczko przypomina wyglądem mleko krowie, po kilku minutach po wypływie z naciętego owocu ścina się i tworzy żel)

Schłodzenie

Mieszanie mechaniczne → żel w płyn

Wstępna filtracja i odwirowanie

Ultrafiltracja

Klarowny i przezroczysty przesącz zagęszcza się w próżni oraz suszy w suszarni rozpyłowej

Mielenie na proszek i pakowanie

Preparat enzymatyczny papainy otrzymywany jest na miejscu (w tropikach) ze względu na wysoką niestabilność - ale jego produkcja jest nieskomplikowana, niedroga - później transport do innych krajów).

Suszenie rozpyłowe polega na rozprowadzeniu cieczy w postaci mgiełki drobnych kropli i poddaniu odparowaniu stosując bardzo wysoką temperaturę (200-250°C). Preparaty w postaci stałej są bardziej stabilne niż preparaty ciekłe.

Otrzymywanie i zastosowanie peptydaz zwierzęcych

Zewnątrzkomórkowe enzymy trawienne:

Enzym	Źródło	Skala produkcji	Główne zastosowanie
Chymozyna	Żołądek młodych cielaków	> 1 t/rok	Serowarstwo
Pepsyna	Żołądek świni	< 1 t/rok	Modyfikacja składników żywności, serowarstwo
Trypsyna	Trzustka świni lub bydła	< 1 t/rok	Modyfikacja składników żywności, hydrolizaty białkowe, odwłasianie skór
Chymotrypsyna	Trzustka świni	< 1 t/rok	Modyfikacja składników żywności, odwłasianie skór

Komercyjne otrzymywanie pepsyny przemysłowej

Rozdrobnienie i mielenie surowca (wyściółko żołądka świni)

Autoliza śluzówki żołądka w obecności HCl

Usunięcie tłuszczu heksanem

Wysolenie solą lub izopropanolem

Rozpuszczenie w wodzie

Filtrowanie, suszenie sublimacyjne (45-55^oC) w próżni

(odparowanie heksanu i izopropanolu)

Mielenie na proszek i pakowanie

Otrzymywanie peptydaz z mikroorganizmów

Enzym	Źródło	Skala produkcji	Główne zastosowanie
Neutralne peptydazy	Bacillus subtilis	> 100 t/rok	Hydrolizaty białkowe, dodatek do proszków do prania, browarnictwo
Kwaśne peptydazy gł. koagulaty białek mleka	Rhizmucor miehei	> 10 t/rok	Serowarstwo
Kwaśne peptydazy	Aspergillus niger, Aspergillus oryzae	> 1 t/rok	Piekarnictwo, wytrawianie skór

Neutralne proteinazy Bacillus subtilis; proteinazy serynowe, metaloproteinazy.

Podpuszczka - handlowa nazwa zalecana dla preparatów z żołądków przeżuwaczy zawierająca głównie chymozyną i w niewielkim stopniu pepsynę (Międzynarodowa Federacja Mleczarska).

Peptydazy pochodzenia mikrobiologicznego zdolne do koagulacji białek mleka zaleca się nazywać koagulantami białek mleka.

Produkcja hydrolizatów białkowych odbywa się w wyniku enzymatycznej lub kwasowej/zasadowej hydrolizy białek)

Enzymatyczne modyfikacja składu i właściwości białek - hydrolizaty białkowe

Enzymatyczna hydroliza białek nie powoduje rozkładu aminokwasów, jest bardziej specyficzna od hydrolizy kwasowej i alkalicznej białek.

W wyniku częściowej proteolizy

• Zmieniają się reologiczne, fizyczne, chemiczne właściwości białek,

• Powstają charakterystyczne cechy smakowe i zapachowe produktów.

Np. hydrofobowe aa schowane wewnątrz cząsteczki białka zostają odsłonięte, najczęściej powstaje gorzki smak, zwiększa się rozpuszczalność, obniża napięcie powierzchniowe, zwiększa się zdolność do emulgowania tłuszczów (tworzenia emulsji) i tworzenia piany, wzrasta strawność i przyswajalność produktu.

Gdy jednak zbyt długo prowadzi się hydrolizę to właściwości emulgujące i tworzenia piany mogą spadać.

Hydrolizaty białek na skalę przemysłową otrzymuje się z:

• białek mleka (kazeiny, albuminy, białka serwatkowe),

• białek mięsa, soi, glutenu pszenicy, fibrynogenu lub kolagenu.

Hydrolizaty białkowe - zastosowanie

1. Jako koncentraty spożywcze i przyprawowe, np. zupy instant, sosy sojowe, przyprawy do pieczenia mięsa, buliony mięsne w proszku,

2. Dodatki do żywności wytwarzające i stabilizujące pianę, emulgujące tłuszcze, modyfikujące smak, poprawiające teksturę i ułatwiające krojenie, np. do parówek,

3. Do otrzymywania żywności przeznaczenia specjalnego:

• odżywki dla niemowląt,

• preparaty odchudzające,

• odżywki białkowe dla sportowców,

• odżywki o obniżonej alergenności dla dzieci „atopowych” oraz z zaburzeniami wchłaniania i trawienia o podłożu immunologicznym, niealergizującym,

4. Wzbogacanie produktów w białko, np. chleba i żywności specjalnej.

Laktoalbumina zawarta w białku serwatkowym mleka krowy oraz albumina jaja zostały uznane za białka o najwyższej wartości odżywczej przez FAO/WHO (nie tylko zawartość egzogennych aminokwasów, ale i proporcje aminokwasów egzogennych do endogennych) => ale RYZYKO REAKCJI ALERGICZNYCH!!!

Odżywki dla dzieci otrzymuje się z białek serwatkowych, kazeiny, białka soi.

Reakcje alergiczne wywołują sekwencje aminokwasowe występujące w białku nazwane EPITOPAMI, przeciw którym organizm produkuje przeciwciała.

W jednym białku może znaleźć się kilka epitopów. Poprzez hydrolizę wiązań peptydowych zmniejszamy rozmiary peptydów => zmniejsza się liczba cząsteczek zawierających 2 lub więcej epitopów lub bezpośrednio rozbijane są sekwencje aminokwasowe epitopu => obniżenie lub pozbawienie właściwości alergizujących.

Proces plasteinowania, jako przykład polepszania jakości białek

• Enzymatyczna reakcja resyntezy wiązań peptydowych (w konkretnych warunkach),

• Enzymatyczne przeprowadzanie hydrolizatów białkowych w peptydy wielkocząsteczkowe, nierozpuszczalne w 10% TCA o konsystencji żelu nazwanego „plasteiną”.

Proces dwuetapowy:

ETAP 1: polega na częściowej hydrolizie wiązań peptydowych białek przy użyciu proteinaz, takich jak pepsyna, papaina, α-chymotrypsyna.

ETAP 2: otrzymany uprzednio hydrolizat białkowy (mieszanina peptydów), po zatężeniu, poddaje się reakcji plasteinowania katalizowanej przez enzymy, takie same bądź inne niż stosowane w procesie hydrolizy, lecz przy pH innym niż w procesie hydrolizy w wyniku, czego otrzymuje się plasteinę charakteryzującą się, w porównaniu z białkiem wyjściowym, lepszym składem jakościowym oraz obniżoną zawartością substancji antyżywieniowych.

Schemat technologiczny otrzymywania plastein

KIERUNKI WYKORZYSTYWANIA REAKCJI PLASTEINOWANIA

1. wbudowywanie aminokwasów egzogennych w białka, np. gluten (białko zapasowe zbóż) w lizynę, zeinę w lizynę, tryptofan,

2. usuwanie niepożądanych aminokwasów w przypadku szczególnych diet, np. w fenyloketonurii konieczne jest wyeliminowanie z produktów fenyloalaniny (do produkcji hydrolizatów wykorzystywane są rybny koncentrat białkowy i białko sojowe),

3. usuwanie gorzkiego smaku hydrolizatów białkowych - usunięcie aminokwasów hydrofobowych lub ich ukrycie wewnątrz długich łańcuchów plastein,

4. usuwanie właściwości alergennych białek - usunięcie części epitopów (z końca N lub C) , rozbicie epitopów lub ich ukrycie wewnątrz łańcuchów plastein => konieczność poznania sekwencji aminokwasowych uczulających.

ZASTOSOWANIE PEPTYDAZ

1. PIEKARNICTWO

• rozluźnienie zbyt mocnego białka glutenowego mąki, co prowadzi do skrócenia czasu wyrabiania ciasta, polepsza jego pulchność i konsystencję (peptydazy grzybowe i bakteryjne),

2. BROWARNICTWO

• podczas przerobu zbożowych surowców niesłodowanych w celu zapewnienia odpowiednich właściwości organoleptycznych (zapachu, pienistości, klarowności) => stabilizacja piwa (szczególne znaczenie przy schładzaniu piwa),

• przy słodowaniu jęczmienia i w początkowej fazie zacierania słodu => odpowiedni stopień rozkładu substancji białkowych,

3. PRZEMYSŁ MIĘSNY

• przyspieszenie procesu dojrzewania mięsa, głównie wołowego, poprzez częściowy rozkład ... białka włókna mięśniowego uzyskuje się poprawę konsystencji (delikatność, kruchość), poprawę wartości odżywczej i cech organoleptycznych => 2-3 x skrócony czas dojrzewania => zwiększona strawność,

• oddzielenie resztek mięsa od kości - zwiększenie odzysku białka,

• zmiękczanie, odwłasianie skór,

• zwiększenie wydajności ekstrakcji tłuszczu,

4. PRZEMYSŁ RYBNY

• dojrzewanie solonych, marynowanych śledzi (pleśnie Aspergillus),

5. MLECZARSTWO

• koagulacja białek mleka w produkcji sera,

• produkcja hydrolizatów kazeiny,

• produkcja mleka sojowego, mleka w proszku,

• w procesie dojrzewania sera - proces złożony, proteoliza niezbędna do uzyskania prawidłowej struktury, głębokiego smaku, dostarczenia aminokwasów niezbędnych do wytworzenia charakterystycznego smaku i zapachu.

Koagulanty wykorzystywane w produkcji i dojrzewaniu serów stosowane są szeroko ze względu na niespecyficzność substratową tych preparatów.

W przypadku podpuszczki niespecyficzna proteoliza nie rozluźnia skrzepu i nie powoduje przechodzenia produktów degradacji kazeiny do serwatki.

Natomiast inne koagulanty białek mleka (trypsyna, chymotrypsyna, papaina) oraz bakteryjne proteinazy hydrolizują niespecyficznie białka mleka - w długim czasie prowadzi to do rozluźnienia skrzepu, strat tłuszczu, strat niskocząsteczkowych związków.

PREPARATY PODPUSZCZKOZASTĘPCZE - cechy:

• duża aktywność ścinająca białka mleka (koagulacja)

• niska niespecyficzna aktywność proteolityczna

Jedynym producentem enzymatycznych preparatów amylolitycznych, pektynolitycznych i proteolitycznych w Polsce są Zakłady Przemysłu Ococowo-Warzywnego PEKTOWIN w Jaśle.

Roztwór białek

Częściowa hydroliza

do peptydów

Endopeptydaza,

np. pepsyna

Odszczepienie niepożądanych aminokwasów

Egzopeptydaza

Rozdzielenie

Niepożądane aminokwasy

Zagęszczenie

Woda

Reakcja plasteinowa w 50 % roztworze substratów

Estry etylowe pożądanych aminokwasów

Rozpuszczalnik organiczny

Rozdzielenie

Frakcja związków małocząsteczkowych

Hydroliza wiązań estrowych

Alkohol etylowy

NaOH

Plasteiny o pożądanym składzie aminokwasowym

---