Biotechnologia III rok, grupa I

Anna Gese, Ryszard Czypicki, Piotr Szewczuk

Raport z ćwiczeń z biotechnologii: Przechowywanie szczepów

I. Wstęp teoretyczny

Głównym wymogiem stawianym metodom przechowywania szczepów jest zapewnienie wydajnych i powtarzalnych procesów biotechnologicznych. Powinny więc one gwarantować wysoką przeżywalność oraz czystość mikrobiologiczną i genetyczną szczepów, ale przede wszystkim zachowanie wyjściowej charakterystyki mikroorganizmów.

Do omówionych na zajęciach metod należą: ustawiczne przeszczepianie (ryzykowne ze względu na możliwość zmian genetycznych i zakażenia, ale dające możliwość ciągłej pracy), przechowywanie na skosie po zalaniu gliceryną lub parafiną (ograniczone do maksymalnie sześciu miesięcy, przy czym gliceryna stwarzać może problemy z przeszczepianiem, a metoda jest skuteczna jedynie dla tlenowców), zamrażanie (gwarantujące zachowanie cech fizjologicznych, przeżywalność wyższą niż przy liofilizacji oraz stosunkowo długi czas przechowywania zależny od zastosowanej temperatury, jednak stwarzające ryzyko zniszczenia komórek przez kryształki lodu, powodujące śmiertelność rzędu 50-60% oraz wymagające długiego czasu ożywiania i uaktywniania szczepu, a także drogiej aparatury; część niekorzystnych efektów można ograniczyć przez stosowanie krioprotektantów, substancji zapobiegających powstawaniu kryształków lodu), liofilizacja (powodująca letalność rzędu 90%, grożąca przetrwaniem klonów najbardziej żywotnych, a nie najwydajniejszych, stwarzająca także problemy z przywróceniem szczepu do stanu sprzed liofilizacji i wymagająca przeprowadzenia antybiogramu zarówno przed, jak i po procedurze przechowywania, jednak gwarantująca bardzo długi czas przechowywania, przez co powszechnie stosowana; również wykorzystuje krioprotektanty) suszenie w warunkach normalnych (bezpieczne, bo symulujące procesy zachodzące naturalnie w środowisku, jednak ograniczone głównie do grzybów i promieniowców sporujących). Wymienić można także suszenie pod obniżonym ciśnieniem czy przechowywanie szczepu w destylowanej wodzie w temperaturze 4˚C, po odpłukaniu pożywki i związków odżywczych.

II. Metody

a) Sprawdzenie żywotności hodowli przed zamrożeniem:

• DROŻDŻE

Kroplę mieszaniny hodowli drożdży i błękitu metylenowego w stosunku 1:1 naniesioną na komorę Thoma i obserwowano przy pomocy mikroskopu świetlnego. Komórki martwe wybarwiają się.

• BAKTERIE

Rozcieńczone sto i tysiąc krotnie wodą destylowaną hodowle bakteryjne barwiono za pomocą zestawu LIVE/DEAD - na 1000µl hodowli 3µl barwników jodku propidyny i zielonego barwnika fluorescencyjnego po zmieszaniu w proporcji 1:1. Hodowle przesączono na krążkach poliwęglanowych aparatem filtracyjnym. Po dodaniu komponentu C z zestawu LIVE/DEAD bakterie obserwowano mikroskopem epifluorestencyjnym. Komórki martwe wybarwiają się na czerwono, żywe na zielono.

b) Przechowywanie materiału biologicznego:

Osady z 1ml hodowli płynnych zawieszono w 1 ml roztworu ochronnego - 10% roztwór glicerolu z dodatkiem 5% laktozy - zamrożono w temperaturach -80 i -20ºC

c) Oznaczenie przeżywalności w hodowlach przechowywanych w stanie zamrożenia:

Zawiesiny rozmrożono w łaźni wodnej w temperaturze 30ºC a następnie bakterie rozcieńczono stu krotnie wodą destylowaną. Liczenie komórek żywych i martwych odbywało się w sposób identyczny z ich liczeniem przed zamrożeniem.

III. Wyniki

a) Sprawdzenie żywotności hodowli przed zamrożeniem:

• BAKTERIE

E.coli

Żywe	martwe	Suma	% żywych	% martwych
30	15	45	66,7	33,3

Bacillus subtilis

Żywe	martwe	Suma	% żywych	% martwych
136	39	175	77,7	22,3

Micrococcus

Żywe	martwe	Suma	% żywych	% martwych
26	5	31	83,9	16,1

• DROŻDŻE

Rozcieńczenie

Żywe	martwe	Suma	% żywych	% martwych
17	0	17	100	0
16	0	16	100	0
20	0	20	100	0
18	0	18	100	0
21	0	21	100	0
16	0	16	100	0
24	0	24	100	0
29	0	29	100	0
29	0	29	100	0
25	0	25	100	0
16	0	16	100	0
20	0	20	100	0
24	0	24	100	0
16	0	16	100	0
21	0	21	100	0
17	0	17	100	0
19	0	19	100	0
21	0	21	100	0
26	0	26	100	0
13	0	13	100	0
20	0	20	100	0
20	0	20	100	0
14	0	14	100	0
25	0	25	100	0
24	0	24	100	0
23	0	23	100	0
25	0	25	100	0
20	0	20	100	0
23	0	23	100	0
16	0	16	100	0

Średnio

żywe	martwe	Suma	% żywych	% martwych
20,6	0	20,6	100	0

b) Sprawdzenie żywotności hodowli po zamrożeniu i rozmrożeniu:

• BAKTERIE W -20ºC

E.coli

żywe	martwe	Suma	% żywych	% martwych
13	5	18	72,2	27,8
12	5	17	70,6	29,4
10	9	19	52,6	47,4
11	6	17	64,7	35,3
13	7	20	65,0	35,0

Średnio

żywe	martwe	Suma	% żywych	% martwych
11,8	6,4	18,2	65,0	35,0

Bacillus subtilis

żywe	martwe	Suma	% żywych	% martwych
1	1	2	50,0	50,0
3	0	3	100,0	0,0
1	2	3	33,3	66,7
4	2	6	66,7	33,3
1	1	2	50,0	50,0

Średnio

żywe	martwe	Suma	% żywych	% martwych
2	1,2	3,2	60,0	40,0

• BAKTERIE W -80ºC

E.coli

żywe	martwe	Suma	% żywych	% martwych
13	4	17	76,5	23,5
13	7	20	65,0	35,0
12	4	16	75,0	25,0
8	3	11	72,7	27,3
5	4	9	55,6	44,4

Średnio

żywe	martwe	Suma	% żywych	% martwych
10,2	4,4	14,6	69,0	31,0

Bacillus subtilis

żywe	martwe	Suma	% żywych	% martwych
6	6	12	50,0	50,0
3	2	5	60,0	40,0
13	8	21	61,9	38,1
5	3	8	62,5	37,5
2	3	5	40,0	60,0

Średnio

żywe	martwe	Suma	% żywych	% martwych
5,8	4,4	10,2	54,9	45,1

• DROŻDŻE W -20ºC

Rozcieńczenie

żywe	martwe	Suma	% żywych	% martwych
13	3	16	81,3	18,8
10	3	13	76,9	23,1
20	4	24	83,3	16,7
12	3	15	80,0	20,0
14	2	16	87,5	12,5
16	2	18	88,9	11,1
14	4	18	77,8	22,2
12	3	15	80,0	20,0
15	4	19	78,9	21,1
11	1	12	91,7	8,3
11	3	14	78,6	21,4
13	1	14	92,9	7,1
16	4	20	80,0	20,0
10	3	13	76,9	23,1
14	3	17	82,4	17,6
13	4	17	76,5	23,5
9	1	10	90,0	10,0
16	3	19	84,2	15,8
16	3	19	84,2	15,8
17	2	19	89,5	10,5

Średnio

żywe	martwe	suma	% żywych	% martwych
13,6	2,8	16,4	83,1	16,9

• DROŻDŻE W -80ºC

Rozcieńczenie

żywe	martwe	suma	% żywych	% martwych
12	1	13	92,3	7,7
7	1	8	87,5	12,5
8	6	14	57,1	42,9
16	2	18	88,9	11,1
16	3	19	84,2	15,8
17	3	20	85,0	15,0
13	3	16	81,3	18,8
14	2	16	87,5	12,5
10	2	12	83,3	16,7
13	3	16	81,3	18,8
18	2	20	90,0	10,0
12	2	14	85,7	14,3
18	2	20	90,0	10,0
14	2	16	87,5	12,5
17	2	19	89,5	10,5
13	4	17	76,5	23,5
18	2	20	90,0	10,0
14	0	14	100,0	0,0
10	2	12	83,3	16,7
9	3	12	75,0	25,0

Średnio

żywe	martwe	suma	% żywych	% martwych
13,45	2,35	15,8	84,8	15,2

c) Podsumowanie wyników:

	Bacillus subtilis		Escherichia coli		drożdże
	% żywych	% martwych	% żywych	% martwych	% żywych	% martwych
przed mrożeniem	78	22	67	33	100	0
-20ºC	60	40	65	35	83	17
-80ºC	55	45	69	31	85	15

IV. Wnioski

Podsumowując uzyskane wyniki należy stwierdzić, że optymalna temperatura do przechowywania mikroorganizmów zależy od gatunku. Metody zastosowane dla Bacillus subtilis, Escherichia coli oraz dla drożdży były identyczne, odnotowano jednak wyraźne różnice w stosunku komórek żywych do martwych dla poszczególnych temperatur w przypadku każdego z mikroorganizmów.

Dla B.subtilis najkorzystniejsza okazała się temperatura przechowywania równa -20˚C, przy której pod koniec eksperymentu uzyskano przeżywalność wynoszącą 60%.

Escherichia coli najlepiej zniosła przechowywanie w temperaturze -80˚C, przy czym przeżywalność była wyższa niż dla B.subtilis i wyniosła 69%.

Również dla drożdży optymalna okazała się temperatura -80˚C. Drożdże, przedstawiciel domeny Eucaryota, okazały się odporniejsze na niskie temperatury aniżeli prokariotyczne bakterie.

Należy zwrócić także uwagę na fakt, że przed przeprowadzeniem procedury mrożenia najwięcej martwych komórek odnotowano wśród E.coli, najmniej zaś (0) wśród drożdży.

5

---