Ćwiczenie 8

Oznaczenie wrażliwości bakterii na antybiotyki β-laktamowe; efekt inhibitorowy kwasu kawulanowego.

Antybiotyki β-laktamowe i inhibitory β-laktamaz

Antybiotyki β-laktamowe stanowią najliczniejszą i najczęściej stosowaną grupę leków przeciwbakteryjnych. Należą do nich penicyliny, cefalosporyny, monobaktamy, karbapenemy i preparaty łączone penicylin z inhibitorami β-laktamaz. Wspólną strukturą chemiczną tej grupy leków jest pierścień β-laktamowy z wiązaniem amidowym C-N podatnym na hydrolityczne działanie β-laktamaz. Działanie bakteriobójcze antybiotyków β-laktamowych polega na blokowaniu biosyntezy peptydoglikanu, miejscem ich docelowego działania są białka wiążące penicyliny (PBP).

Oporność bakterii na antybiotyki β-laktamowe związana jest z czterema mechanizmami:

• wytwarzaniem enzymu hydrolizującego wiązanie amidowe pierścienia β-laktamowego (β-laktamazy);

• pojawieniem się w komórce nowego białka PBP o niskim powinowactwie do antybiotyków β-laktamowych, ale pełniącego funkcję w procesie syntezy ściany komórkowej;

• zaburzeniami w przepuszczalności struktur powierzchniowych poprzez zamknięcie lub zmniejszenie wielkości kanałów porynowych

• aktywnym usuwaniem antybiotyku z komórki bakteryjnej.

β-laktamazy (penicylinazy, cefalosporynazy, karbapenemazy) są wytwarzane zarówno przez bakterie Gram-dodatnie (S. aureus, E. faecalis, Bacillus spp., Mycobacterium spp.), jak Gram-ujemne (E. coli, Proteus sp., Pseudomonas aeruginosa, Klebsiella).

Związki hamujące aktywność β-laktamaz określono jako inhibitory β-laktamaz. Związki te reagują z centrum aktywnym enzymu powodując jego inaktywację i uniemożliwiają jego działanie na antybiotyki β-laktamowe. Inhibitorami β-laktamaz są: kaws klawulanowy, sulbaktam, tazobactam. Związki te w połączeniu z antybiotykiem β-laktamowym umożliwiają mu wniknięcie do komórki bakteryjnej i związanie z białkami PBP. Aktywność β-laktamaz hamują także penicyliny fenylowe, naftylowe i chinolinowe.

Kwas klawulanowy wytwarzany jest przez Streptomyces clavuligerus i S. jumonjinesis. Stosowany jest łącznie z ampicyliną, amoksycyliną, cefalotyną i cefazoliną (w Polsce stosowane są preparaty kwas klawulanowy i amoksycylina oraz tikarcylina).

Połączenia penicylin z inhibitorami beta-laktamazy

Preparaty: Amoksiklav - Lek; Amoksiklav forte - Lek; Augmentin - Polfa Tarchomin; Augmentin - SmithKline Beecham; Tazocin - Wyeth-Lederle; Timentin - SmithKline Beecham ; Unasyn - Polfa Tarchomin; Unasyn - Pfizer .

Wykonanie ćwiczenia

Szczepy

1. Stapylococcus aureus ATCC 25923 - wrażliwy

2. Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 - oporny

3. Pseudomonas sp.267

4. Escherichia coli ATCC 35218 - oporny

5. Escherichia coli ATCC 25922 - wrażliwy

6. Eschericha coli pBR322

7. Eschericha coli HB101

Podłoża bakteryjne i antybiotyki

1. LB płynne

2. LB stałe

3. Płyki LB z augmentinem i amoksycyliną (stężenie końcowe 10 mg/ml)

4. Augmentin (kwas klawulanowy + amoksycylina) 100 mg/ml

5. Amoksycylina 100 mg/ml

6. Krążki antybiotykowe: amoksycyklina, ampicylina, penicylina G, augmentin

Wykonanie

1. Przygotowanie serii rozcieńczeń antybiotyków (augmentin i amoksycylina)

wg schematu

Obj. bulionu LB (ml)	5	5	5	5	5	5	5	5	5	5
Obj. dodanej hodowli (μl)	50	50	50	50	50	50	50	50	50	50
Obj. antybiotyku (μl)	x	x	x	x	x	x	x	x	x	x
Stęż. końcowe antybiotyku (mg/ml)	0.00	0.05	0.10	0.30	0.45	1.0	2.0	4.0	6.0	12.0

Inkubować przez 24 godziny w temperaturze 28ºC, następnie wykonać pomiar OD₅₅₀ po 24 godzinnej inkubcji wobec kontroli-bulionu. Na podstawie uzyskanych wyników określić MIC (minimalne stężenie antybiotyku hamujące wzrost bakterii). W celu oznaczenia MBC (stężenie bakteriobójczego) wysiać po 10 μl hodowli bakteryjnych z probówek zawierających różne stężenia antybiotyków (augmentin i amoksycylina) na płytki z podłożem LB.

2. Produkcja β-laktamazy przez szczepy Pseudomonas sp.267 i E. coli

z plazmidem oporności na β-laktamy

a) Przygotować płytki z podłożem LB i wysiać na nich bakterie wg rys.

Płytki serii A,B,C zawierają w podłożu ampicylinę w stężeniu 10mg/ml.

Płytki serii A1,B1,C1 zawierają w podłożu augmentin w stężeniu 10 mg/ml.

b) Na płytki A, A1 wysiać grubą rysą szczep Pseudomonas sp.267

Na płytki B, B1 wysiać grubą rysą szczep E. coli pBR322 lub inny

Na płytki C, C1 wysiać grubą rysą szczep S.aureus

c) Po 24h bakterie zabić parami chloroformu.

d) Wszystkie płytki zalać zawiesiną bakterii E. coli HB101 w agarze miękkim (0.7%). Płytki inkubować w 28°C przez 2-3 dni. Odczytać uzyskane wyniki. Szczepy produkujące β-laktamazy rozkładają antybiotyk dodany do podłoża,a szczep wrażliwy na antybiotyki β-laktamowe ( E. coli HB101) będzie rósł na tym podłożu.

3. Określanie wrażliwości szczepów Pseudomonas, Staphylococcus, E. coli na β-laktamy oraz inne antybiotyki metodą dyfuzyjno-krążkową.

Na płytki z podłożem LB wysiać w postaci „murawy” 0,1ml płynnej hodowli poszczególnych szczepów. Po 5 min. nałożyć jałowo krążki z antybiotykami (ampicylina, amoksycylina, augmentin, penicylina G). Inkubować w 37º C, po 24 godzinach zmierzyć strefy zahamowania wzrostu bakterii, na ich podstawie określić czy szczep jest wrażliwy, średniowrażliwy czy oporny na dany antybiotyk.

12

---