Ćwiczenie I - Przechowywanie szczepów bakteryjnych

1. Wykonanie ćwiczenia

1. wylać 10 płytek z pożywką LB, po zestaleniu podłoża wysuszyć płytki

2. całonocną hodowlę bakterii (25 ml) E. coli odwirować (10 min, 5 tys rpm) i zawiesić w 15 ml świeżej, płynnej pożywki LB

3. w probówkach Eppendorfa wykonać szereg rozcieńczeń hodowli w wodzie, w końcowej objętości 1 ml (do 10^-10) i wysiać na płytki z pożywką LB

4. hodowlę bakteryjną w świeżej pożywce poddać poniższym metodom konserwacji (patrz tabela), po okresie przechowywania (kilka tygodni) odmłodzić bakterie i ocenić przeżywalność komórek oraz przydatność metod

Metody przechowywania szczepów bakteryjnych:

Metoda	Sposób wykonania (ćwiczenie bieżące)	Sposób odmłodzenia (ćwiczenie XII)
1. Przechowywanie w pożywce w obniżonej temperaturze	Pobrać z kolbki 3 ml zawiesiny bakterii do jałowej probówki, zakorkować, przechowywać w temp. 4-5°C	Wykonać szereg rozcieńczeń i wysiać zawiesiny bakteryjne na podłoża stałe
2. Przechowywanie w pożywce w obniżonej temperaturze pod parafiną	Pobrać z kolbki 3 ml zawiesiny bakterii do jałowej probówki, zalać jałowym olejem parafinowym (warstwa o grubości 1.5-2 cm), zakorkować, przechowywać w temp. 4-5°C	Wykonać szereg rozcieńczeń i wysiać zawiesiny bakteryjne na podłoża stałe
3. Przechowywanie w temp. -20°C	W jałowej probówce Eppendorfa zmieszać 0.5 ml zawiesiny bakteryjnej i 0.5 ml jałowego glicerolu, dobrze wymieszać, mieszaninę umieścić w temp. -20°C Uwaga!!! Przygotować dodatkowo probówkę z bakteriami bez dodatku glicerolu, zamrozić	Wykonać szereg rozcieńczeń i wysiać zawiesiny bakteryjne na podłoża stałe
4. Przechowywanie w temp. -70°C	W jałowej probówce Eppendorfa zmieszać 0.85 ml zawiesiny bakteryjnej i 0.15 ml jałowego glicerolu, dobrze wymieszać, zamrozić w ciekłym azocie a następnie przechowywać w temp. -70°C Uwaga!!! Przygotować dodatkowo probówkę z bakteriami bez dodatku glicerolu, zamrozić w ciekłym azocie, przechowywać w temp. -70°C	Uwaga!!! Delikatnie rozmrozić w lodzie. Wykonać szereg rozcieńczeń i wysiać zawiesiny bakteryjne na podłoża stałe
5. Suszenie na bibule	Nanieść po kilka kropel zawiesiny bakteryjnej na jałowe paski bibuły rozłożone wewnątrz płytki Petriego; paski wysuszyć pod zmniejszonym ciśnieniem w eksykatorze, wysuszone paski przenieść do jałowej probówki i przechowywać w temp. 4-5°C Uwaga!!! Przygotować dodatkowo paski bibuły bez bakterii (kontrola sterylności)	Paski bibuły umieścić w probówce z płynną pożywką LB i inkubować w cieplarce
6. Zatapianie w żelatynie	2 ml zawiesiny bakteryjnej zmieszać z 2 ml 30% żelatyny (upłynnionej w temp. 30-40°C), mieszaninę pobrać do pipety, nakraplać na paski bibuły rozłożone wewnątrz płytki Petriego, po zestaleniu żelatyny suszyć pod zmniejszonym ciśnieniem w eksykatorze Uwaga!!! Przygotować dodatkowo paski bibuły z żelatyną bez bakterii (kontrola sterylności)	Paski bibuły umieścić w probówce z płynną pożywką LB i inkubować w cieplarce

2. Opracowanie wyników

- obliczyć miano bakterii dla hodowli wyjściowej (na ćwiczeniu III)

- obliczyć miano bakterii dla hodowli poddawanych przechowywaniu (na ćwiczeniu XIII)

- porównać otrzymane wyniki i obliczyć przeżywalność bakterii przy zastosowaniu poszczególnych metod przechowywania

- wyniki przedstawić w tabeli

Metoda przechowywania	Miano hodowli wyjściowej	Miano hodowli po okresie przechowywania	Przeżywalność (%)

Materiały i sprzęt:

- hodowla nocna (25 ml) Escherichia coli

- LB płynne 2 x 25 ml (jedno do przygotowania hodowli nocnej)

- LB stałe (400 ml)

- 3 ml oleju parafinowego

- 3 ml 30% żelatyny

- 3 ml glicerolu

- 20 płytek Petriego

- 10 probówek długich

- jałowe probówki Eppendorfa

- pipety automatyczne

- jałowe końcówki do pipet

- głaszczki

- jałowe paski bibuły (kilka sztuk) + pęseta

- pipety szklane (10 ml, 5 ml, 1 ml)

- 2 gilzy do wirowania + 2 płaszcze

- 100 ml jałowej wody

- eksykator

- łaźnia wodna

- ciekły azot do zamrożenia hodowli

---