Ćwiczenie II - Symbiotyczne wiązanie azotu

Przygotować:

1. Szczepy Rhizobium leguminosarum bv. trifolii

1. oporne na streptomycynę (Str^R)

2. oporne na rifampicynę (Rif^R)

wysiane na płytki z podłożem TY

2. Szczepy Phyllobacterium trifolii i Rhizobium leguminosarum TA1

3. Wyjałowione i skiełkowane nasiona koniczyny

Jałowienie nasion i przygotowanie kiełków do zakażenia:

- nasiona koniczyny płukać trzykrotnie jałową wodą destylowaną

- jałowić powierzchniowo 0.1% HgCl₂ przez 3 min

- płukać trzykrotnie jałową wodą destylowaną

- jałowić 75% etanolem przez 3 min

- ponownie trzykrotnie płukać jałową wodą destylowaną

- wyjałowione nasiona rozłożyć na płytkach z podłożem dla roślin (podłoże „R” - nie zawiera związków azotu)

- płytki z nasionami przechowywać w ciemności do czasu wykiełkowania (1-2 dni)

Pożywka „R”:

K2HPO4 MgSO4 NaCl Ca(PO4)2 FeSO4 Agar Woda pH

0.5 g 0.2 g 0.1 g 2.0 g 0.01 g 8-10 g do 1000 ml 7.0

Wykonanie:

1. Kiełkujące nasiona koniczyny jałowo przenieść z płytek na skosy z pożywką „R” (1 kiełek 1 probówka)

2. Probówki z kiełkami podzielić na sześć grup doświadczalnych (po kilkanaście roślin każda):

1. nie zakażone bakteriami

2. zakażone szczepem Rhizobium leguminosarum bv. trifolii Str^R

3. zakażone szczepem Rhizobium leguminosarum bv. trifolii Rif^R

4. zakażone dwoma szczepami: Rhizobium leguminosarum bv. trifolii Str^R i Rif^R

5. zakażone szczepem R. leguminosarum bv. trifolii TA-1

6. zakażone szczepem Phyllobacterium trifolii PETP02^T

3. Przygotować zawiesiny bakteryjne do zakażenia roślin - bakterie rosnące na płytkach zawiesić w ok. 5 ml jałowej wody destylowanej (gęstość OD₅₅₀ = 0.2)

4. Zakażenie roślin: do probówek z kiełkami koniczyny dodać:

grupa nie zakażona bakteriami	po 100 μl jałowej wody destylowanej
grupa zakażona szczepem Str^R	po 100 μl zawiesiny bakterii Rhizobium leguminosarum bv. trifolii Str^R
grupa zakażona szczepem Rif^R	po 100 μl zawiesiny bakterii Rhizobium leguminosarum bv. trifolii Rif^R
grupa zakażona dwoma szczepami: Str^R i Rif^R	Po 50 μl zawiesiny bakterii Rhizobium leguminosarum bv. trifolii Str^Roraz 50 μl zawiesiny bakterii Rhizobium leguminosarum bv. trifolii Rif^R
grupa zakażona Phyllobacterium trifolii	po 100 μl zawiesiny bakterii P. trifolii
Grupa zakażona R. leguminosarum bv.trifolii TA1	po 100 μl zawiesiny bakterii R. leguminosarum bv.trifolii TA1

Materiały:

- Rhizobium legumiosarum bv. trifolii Str^R na płytce z podłożem TY

- Rhizobium legumiosarum bv. trifolii Rif^R na płytce z podłożem TY

- Phyllobacterium trifolii na płytce z podłożem TY

- R. leguminosarum bv.trifolii TA1 na płytce z podłożem 79CA

- 20 probówek długich

- 2x po 100 ml jałowej wody destylowanej

- 1 koszyk skosów z pożywką „R” (60 skosów)

- 0.1% r-r HgCl₂

- etanol 75%

- pipety automatyczne

- końcówki do pipet

- pipety szklane

- ezy

---