Ćwiczenie III/IV - Krzywa wzrostu stacjonarnej hodowli Escherichia coli i represja glukozowa

Wykonanie:

1. Przygotować nocną hodowlę E. coli DH5α w 5 ml płynnej pożywki LB

2. 100 ml pożywki M9 z glukozą i laktozą (w kolbie 250 ml) zaszczepić 1 ml nocnej hodowli E. coli DH5α

3. Pobrać 5 ml odmłodzonej hodowli (czas T₀) do probówki, a pozostałą część hodowli znajdującej się w kolbie inkubować z wytrząsaniem w 37°C

4. Co 20 minut z kolby pobierać po 5 ml próbki hodowli do probówki, oznaczając kolejne czasy jako T₁, T₂ itd.

5. Dla każdej pobranej z hodowli próbki oznaczyć:

1. Gęstość optyczną hodowli

2. Liczbę żywych komórek w hodowli

3. Aktywność β-galaktozydazy

4. Ilości białka metodą Lowry'ego

Pomiar gęstości optycznej hodowli:

- przenieść 1 ml próbki pochodzącej z hodowli do kuwety spektrofotometru

- zmierzyć OD₅₅₀ wykorzystując jako próbę kontrolną 1 ml płynnej pożywki M9 z glukozą i galaktozą

Oznaczenie liczby żywych komórek:

- przenieść 0.1 ml próbki pochodzącej z hodowli do probówki Eppendorfa zawierającej 0.9 ml jałowej wody (rozcieńczenie 10^-1), a następnie wykonać dalszą część szeregu rozcieńczeń w jałowej wodzie

- zakres szeregu rozcieńczeń dopasować do gęstości optycznej hodowli, przyjmując, że OD₅₅₀=0.05 to około 10⁷ - 10⁸ bakterii/ml, OD₅₅₀=0.20 to około 10⁹ bakterii/ml, a OD₅₅₀=0.50 to około 10⁹ - 10¹⁰ bakterii/ml

- po wykonaniu szeregu rozcieńczeń, 4 ostatnie rozcieńczenia z szeregu wysiać na płytki ze stałą pożywką LB, po 100 µl zawiesiny na płytkę

Oznaczenie aktywności β-galaktozydazy:

- przenieść 1 ml próbki pochodzącej z hodowli do probówki Eppendorfa, zamrozić w ciekłym azocie i przechowywać w -20°C

- oprócz próbek pochodzących z różnych etapów hodowli, przygotować próbę kontrolną zawierającą 1 ml płynnej pożywki M9 z glukozą i galaktozą

- przed oznaczeniem próbkę rozmrozić

Oznaczanie ilości białka metodą Lowry'ego:

- przenieść 1 ml próbki pochodzącej z hodowli do probówki Eppendorfa, odwirować przez 3 minuty

- odrzucić supernatant a otrzymany osad bakteryjny zamrozić i przechowywać w -20°C

- przed oznaczeniem osad rozmrozić

Zestawić otrzymane wyniki - zaobserwować, jak w trakcie prowadzenia hodowli zmienia się jej gęstość, liczba żywych komórek i ilość białka, oraz kiedy pojawia się aktywność β-galaktozydazy świadcząca o zniesieniu represji katabolicznej.

Materiały i odczynniki:

- nocna hodowla E. coli DH5α w 5 ml płynnej pożywki LB

- 100 ml pożywki M9 z glukozą i galaktozą (w kolbie 250 ml)

- 10 ml pożywki M9 z glukozą i galaktozą w kolbce

- 800 ml stałego podłoża LB

- 40 płytek Petriego

- jałowa woda destylowana

- probówki Eppendorfa

- 10 krótkich probówek szklanych

- głaszczki

- pipety szklane i automatyczne

- końcówki do pipet

---