KWASY NUKLEINOWE

* SKŁAD CHEMICZNY KWASÓW NUKLEINOWYCH.

Kwasy nukleinowe zbudowane są z nukleotydów. Każdy nukleotyd zbudowany jest z zasady azotowej połączonej wiązaniem N-glikozydowym z cukrem oraz reszty fosforanowej. Zasady pirymidynowe (6) to cytozyna i tymina (uracyl w RNA), zasady purynowe(5+6) to adenina i guanina. Uracyl różni się od tyminy grupą metylową w pozycji C5 heterocyklicznego pierścienia tyminy.

W skład kwasów wchodzą dwa typy pentoz: ryboza i deoksyryboza. W skład RNA wchodzi ryboza która ma w pozycji 2' grupę hydroksylową.

Wiązanie N-glikozydowe utworzone jest pomiędzy C1 pentozy a N1 pirymidyny lub N9 puryny.

Zasada azotowa połączona z cukrem to nukleozyd, a gdy do tego przyłączona jest reszta fosforanowa, nukleotyd (ester fosforanowy nukleozydu).

Szkielet łańcucha polinukleotydowego tworzą jednostki cukrów połączone ze sobą resztami fosforanowymi. Grypa 5'-OH pierścienia wiąże się z grupą 3'-OH następnego pierścienia wiązaniem fosfodiestrowym (5'-3').

Prekursorami syntezy kwasów są 5'-trifosforany nukleozydów (NTP).

Podwójna helisa jest prawoskrętna. Guanina tworzy trzy wiązania z cytozyną, a tymina dwa z adeniną.

* SEMIKONSERWATYWNA REPLIKACJA DNA.

Jest to enzymatyczna synteza nowej nici DNA na bazie starej. Miejsce rozdzielenia nici to widełki replikacyjne, podczas replikacji przesuwają się wzdłuż macierzystego DNA (3000 nukleotydów na minutę). Replikacji dokonują polimerazy DNA i RNA.

* STRUKTURA KWASÓW NUKLEINOWYCH.

Struktura pierwszorzędowa to kolejność nukleotydów w łańcuchu polinukleotydowym. Struktura drugorzędowa to dwa helisowo zwinięte łańcuchy polinukleotydowe utrzymywane wspólnie wiązaniami wodorowymi między komplementarnymi zasadami. Struktura trzeciorzędowa to specyficzna konfiguracja w przestrzeni wielkocząsteczkowego, podwójnego heliksu DNA. Struktura czwartorzędowa to oddziaływanie wzajemne cząsteczek DNA, mających swoją określoną strukturę I, II i III rzędową.

* ALTERNATYWNE STRUKTURY PODWÓJNEJ HELISY.

(tabela strona 35.)

* REPLIKACJA DNA.

Wieloetapowy proces enzymatyczny który zapewnia wierne powielenie jego cząsteczki macierzystej. U eukaryota 3000/minutę, u bakterii 30000/minutę.

Inicjacja: znalezienie miejsca inicjacji replikacji(u Eukaryota - Ori C) , synteza krótkich odcinków RNA - starterów(kompleks białkowy - prymosom)

Elongacja: przebiega przy udziale replisomu(DNA, helikazy, prymosom, polimerazy DNA oraz białka SSB)

Terminacja: precyzyjny koniec po rozpoznaniu określonej sekwencji DNA

* BAKTERYJNE POLIMERAZY DNA.

Polimeraza DNA I, wymaga do syntezy DNA 4 5'-trójfosforanów deoksyrybonukleozydów (dATP, dGTP, dCTP, dTTP oraz jonów Mg²⁺) - do rozpoczęcia syntezy in vivo konieczne krótkie odcinki starterowe RNA z wolną grupą 3'-OH i matryca DNA. Odgrywa również rolę w naprawie DNA i degradacji kwasów nukleinowych. Masa 103kD kodowana przez polA. W wyniku cięcia enzymu powstają fragment Klenowa(ma aktywność polimerazy oraz 3'-5'egzonukleazy o masie 68kD i mniejszy o masie 35kD. Koniec 2/3-COOH polimerazy ma aktywność polimerazową, a 1/3-NH₂ nukleazy. Fragment 35kD ma zdolność usuwania odcinków starterowych RNA i uzupełniania braków i usuwania dimerów pirymidynowych. Polimeraza DNA I dodaje nukleotydy do końca 3' i usuwać nukleotydy do końca 5' = nick replikacja (przemieszczanie pęknięć).

Polimeraza II, posiada aktywność 5'-3' polimerazową i 3'-5' egonukleazową. Pojedynczy peptyd o masie 120kD.

Polimeraza III, posiada aktywność 5'-3' polimerazy i 3'-5' egzonukleazy. Brak jej aktywności 5'-3' egzonukleazy charakterystycznej dla polimerazy DNA I. Ma masę 900kD zbudowany z 10 rodzajów łańcuchów polipeptydowych. Ma najwyższą właściwość replikacyjne( 15x większa niż DNA I i 300x większa niż DNA II). Zbudowany z podjednostek α, ε i θ. Podjednostka α ma akt. polimerazową natomiast podjednostka ε to egzonukleaza 3'-5'. Przyłączenie podjednostki τ usyskuje zdolność do dimeryzacji, a następnie do przyłączania kolejnych podjednostek (δ, δ', φ, χ, ψ). Po dołączeniu podjednostek β, warunkującej wysoką procesywność enzymu, kompleks jest utoworzony - taka budowa umożliwia zaklinowanie matrycy DNA w utworzonym pierścieniu, a pozostała wolna przestrzeń umożliwia presuwanie cząsteczek enzymu podczas replikacji

* POLIMERAZY DNA U EUKARYOTA.

5 rodzajów polimeraz; właściwymi są polimeraza α i δ;

Polimeraza α składa się z podjednostki katalitycznej i prymazy (2 peptydy) oraz polipeptydu który łączy podjednostkę katalityczną z prymazą w kompleks; bierze udział w syntezie starterów i towarzyszących im krótkich odcinków DNA, nie ma aktywności 3'-5' egzonukleazy

Aktywność polimeryzacyjna DNA δ zależy od czynnika podziałów komórkowych PCNA (Poliferating Cell Nuclear Antigen) zbudowana z 2 podjednostek, większa wykazuje aktywność 3'-5' egzonuklezy

Polimeraza ε i β uczestniczą w procesach naprawczych DNA, polimeraza e bierze udzał w syntezie DNA, jej aktywność zależy od białek PCNA, posiada również aktywność 3'-5' egzonukleazy podobnie jak polimeraza δ.
Funkcja polimerazy b nie jest znana, pewnie jest to naprawa DNA

Polimeraza φ, nazwana mitochondrialną polimerazą, bierze udział w replikacji mitochondrialnego DNA

* INICJACJA SYNTEZY DNA W MIEJSCACH ORIGIN.

Inicjacja rozpoczyna się w miejscu origin (ori) = miejsca inicjacji replikacji. W bakteryjnym i wirusowym DNA jest to jedno miejsce, u eukaryota jest ich wiele. Region cząsteczki DNA ulegający replikacji to replikon. U E. coli miejsce to nazwano Ori C zbudowane z 245 par zasad (2 sekwencje powtarzające się). Rozpoznawane są przez białka biorące udział w tworzeniu struktur θ

* STARTERY RNA

Polimerazy DNA wymagają krótkich odcinków RNA z wolną grupą 3'-OH = starterów(primerów). Syntezę katalizują prymazy. U E.coli dwa enzymy: polimeraza RNA (uczestnicząca w transkrypcji) i prymaza. Startery RNA mają długość od 10 do 60 nukleotydów u prokaryota i ok. 10 nukleotydów u Eukaryota. Nie mają właściwości naprawczych; są usuwane przez polimerazy DNA, a miejsca po nich wypełnione i połączone przez ligazy DNA

* WIDEŁKI REPLIKACYJNE

Replikację kolistych cząsteczek dwuniciowego DNA określa się jako replikację typu θ (theta), punkty rozgałęzienia się replikacyjnych oczek nazwano widełkami replikacyjnymi. Jedna z nici w kierunku 5'-3' syntezowana jest bez przerw = nić wiodąca, natomiast druga syntezowana w postaci fragmentów Okazaki = nić opóźniona

* HELIKAZY, BIAŁKA SSB, TOPOIZOMERAZY I LIGAZY

Do zainicjowania replikacji konieczne jest rodzielenie helisy, uczestniczą w tym helikazy DNA rozcinające wiązania wodorowe kosztem energii z ATP; ponownemu zwinięciu helisy zapobiegają białka SSB (ich przyłączanie jest kooperatywne tzn. wiązanie jednej stymuluje wiązanie następnych) - bez nich powstawać by mogły szpilki do włosów.
Rozplecenie nici DNA w kolistej bakteryjnej cząsteczce DNA w miejscu widełek replikacyjnych powoduje wprowadzenie dodatnch superskrętów (odcinek 10 nukleotydów - 1 obrót helisy). Odpowiednie obroty wokół osi cząsteczki DNA zapewniają topoizomerazy DNA (przecinające wiązania fosfodiestrowe):
- topoizomeraza I - katalizuje przejściowe rozerwanie pojedynczej nici w helisie - rozluźnia ujemne superskręty, łączy się z DNA za pośrednictwem tyrozyny znajdującej się w centrum aktywnym enzymu; tyrozyna łączy się kowalencyjnie grupą hydroksylową z resztą fosforanową związaną z węglem 5' deoksyrybozy i powstaje wiązanie fosfodiestrowe. Fosfotyrozyna magazynuje energię wykorzystywaną w ponownym łączeniu rozerwanej nici DNA
- topoizomeraza II - katalizuje przejściowe rozerwanie obydwu nici w helisie - relaksują ujemne i dodatnie superskręty, wymaga ATP i polega na rozerwaniu dwóch nici DNA w helisie, przeciągnięcie innego regionu dupleksu przez powstałą przerwę

Topoizomerazy uczestniczą w tworzeniu lub rozwijaniu ketenatów - ketenacja to proces zaplatania nici polinukleotydowych w struktury przypominające ogniwa łańcucha w dwuniciowym DNA; najlepiej poznaną topoizomerazą jest gyraza DNA wyizolowana z E. coli (składa się z dwóch podjednostek α(kodowana przez gyr A) i dwóch β(gen gyr B).Gyraza DNA katalizuje tworzenie truktur superhelikalnych i generuje ujemne superskręty w bakteryjnym kolistym DNA, powstaje napięcie torsyjne, wymaga ATP. Gyraza zmienia dodatnie skręty w ujemne wykonując 100 superskrętów na minutę. Przy braku ATP gyraza może relaksować negatywne a nie dodatnie skręty

Fragmenty Okazaki oddzielone są od siebie lukami (nicks), w ich łączeniu biorą udział ligazy DNA (katalizują tworzenie wiązań fosfodiestrowych między resztami 3'-OH i 5'P) źródłem energii u bakterii jest NAD+ a u eukaryota ATP.
- ligaza aktywowana przez przyłączenie ATP (kompleks enzym-AMP; wiązanie fosfoamidowe przez resztę N-aminową
lizyny)
- kompleks łączy sę z resztą fosforanową przy węglu 5' przerwanego łańcucha DNA przez resztę lizyny i powstaje
adenylan-DNA
- grupa 3'-OH przerwanej nici DNA łączy się z grupą OH reszty fosforanowej związanej z węglem 5' i powstaje wiązanie
fosfodiestrowe z uwolnieniem AMP

* MECHANIZM REPLIKACJI U PROKARYOTA (E. COLI)

W miejscu inicjatorowym Ori C, cztery cząsteczki białka inicjatorowego Dna A przyłączają się do sekwencji Ori C w miejscu czterech powt. dziewięciu nukleotydów - w tym miejscu powstaje oczko replikacyjne. Do białek Dna A przyłączają się inne cząsteczki tego białka tworząc rdzeń składający się z 20-40 polipeptydów, wokół rdzenia zostaje owinięta cząsteczka DNA, w tym procesie uczestniczą białka HU i IHC.Początkowo dochodzi do rozdzielenia w odcinkach 13 nukleotydowych

(….) / 52str.

* TERMINACJA REPLIKACJI DNA.

Terminacja replikacji u bakterii zachodzi w regionie obejmującym ok. 350pz. Region zawiera sekwencje Ter o długości 23pz. Sekwencje są aktywne w jednej orientacji i są specyficzne w stosunku do kierunku ruchu widełek replikacyjnych. W procesie terminacji uczestniczy białko tus zbudowane z 309 aminokwasów - rozpoznaje sekwencje terminacji i zatrzymuje poruszające się widełki replikacyjne. U E.coli jest sześć sekwencji terminacyjnych (Ter E, D, A, F, B, C)

EKSPRESJA GENÓW

1. Kod genetyczny
   
   to sposób zapisania informacji dziedzicznej w DNA lub RNA. Literą kodu genetycznego jest jeden nukleotyd zawierający określoną zasadę azotową; słowa kodu genetycznego to triplety (64 możliwości). Jeden aminokwas jest kodowany przez triplet co odpowiada komplementarnej trójce zasad w mRNA (kodon).
   Kodony synonimowe to te kodujące ten sam aminokwas. Kodony zawierające informację o aminokwasie (61) + 3 kodony stop: UAA(ochre), UAG(amber), UGA(opal)

• Cechy kodu genetycznego
  
  - trójkowy
  - uniwersalny
  - niezachodzący
  - bezprzecinkowy
  - wieloznaczny (zdegenerowany) - dany aminokwas kodowany przez różne kodony,
  aminokwasy najczęściej występujące w białkach posiadają najwięcej kodonów (Ser, Leu, Arg)

2. Materiał genetyczny
   
   nie istnieje zależność między rozmiarami organizmu a ilością DNA w komórkach, znaczną ilość DNA organizmów wyższych stanowi heterochromatyna

• Heterogenność DNA
  
  wyróżnia się trzy typy DNA u Eukaryota:
  - DNA ulegające natychmiastowej renaturacji, DNA wysoce powtarzalne, satelitarne, istniejące w olbrzymiej liczbie kopii (10-15% genomu), głównie w okolicy centromerów chromosomów (prążki C), nie ulega ekspresji
  - najliczniej występujący składający się z krótkich sekwencji tandemowych (5-10 pz.), powtarzające się
  - dłuższe sekwencje tandemowe (100-200pz.)
  - rozproszone sekwencje bardzo często powt. - minisatelity, rozmieszczone poza heterochromatyną
  konstytutywną (prążki C)
  - nici ulegające renaturacji wolnej, umiarkowanie powtarzalne (20-40% genomu), zbudowany z powt. sekwencji lecz najdłuższe liczą do 1000 pz. (charakterystyczne dwie rodziny sekwencji)
  - sekwencje SINE - krótkie rozproszone powtórzenia, sekwencje Alu (300pz., 500000 kopii w genomie),
  elementy Alu należa do retrotranspozonów = po replikacji przemieszczają się w inne miejsce genomu
  poprzez transkrypcję RNA i późniejszą odwrotną tranksrypcję RNA na DNA
  - sekwencje LINE - długie rozproszone powtórzenia, najdłuższe z niekodujących, otoczone regionami
  bogatymi w pary AT (6400pz, 100000 kopii w genomie), należa do retrotranspozonów
  - DNA renaturujący bardzo wolno, sekwencje unikalne (np. gen fibroiny jedwabiu)
  

• Ogólna budowa genów kodujących białka
  
  W budowie genu u eukaryota wyróżnia się: region 5' flankujący (sekwencje niezbędne do prawidłowego przebiegu transkrypcji; najbliżej regionu sekwencje regulatorowe), części kodujące genu i części niekodujące, region 3' flankujący
  -100pz od rozpoczęcia transkrypcji - region promotorowy; -70 do -80 sekwencja CAAT do której przyłączają się białkowe czynniki transkrypcyjne; -25 do -30 sekwencja TATA (TATA box; u prokaryota Pribnow box w odległości -10pz) - przyłącza się tu polimeraza RNA II. W miejscu inicjacji transkrypcji znajduje się puryna następnie fragment niekodujący i sekwencja AUG.
  Eksony to sekwencje przepisane, odnalezione w mRNA cytozolowych (są także fragmenty niekodujące: w pozycji 5' przed tripletem AUG i w pozycji 3' poniżej pierwszego kodonu STOP).
  Intron to sekwencja przepisana, następnie wyeliminowana przez wycęcie w trakcie dojrzewania transkryptu pierwotnego.
  W regionie 3' flankujących przed końcem ostatniego eksonu (10-20 pz.) znajduje się sekwencja AATAAA (niewłaściwie nazywana sekwencją poliadenylacji) - sekwencja rozpoznawcza dla odcięcia transkrypu pierwotnego (hnRNA). Odcięcie następuje poniżej w regionie bogatym w C i T, no końcu regionu są mało znane sekwencje regulatorowe.
  

• Geny niepodlegające regulacji
  
  Geny kodujące białka wszechobecne - house-keeping genes, są to geny konsultatywne, funkcjonujące przez cały okres życia komórki. Posiadają wiele wspólnych właściwości: stały i niski poziom transktypcji (co nie wyklucza regulacji), brak kasety TATA, zawiera powtarzające się niemetylowane pary CG, obecność w niekodującym regionie 5' jednej lub wielu sekwencji GGGGCGGG (kaseta GC) - miejsce wiązania białka uczestniczącego w transkrypcji - Sp1 (jeden z pierwszych wykrytych czynników transkrypcyjnych).

• Pseudogeny
  
  to sekwencje nie podlegające tranksrypcji, transklacji; są zmienionymi elementami rodzin genowych. Brak funkcjonalności może wynikać z wielu kodonów STOP, z braku metioniny lub braku regionu promotorowymi.
  Istnieją dwa typy pseudogenów:
  - pseudogeny z intronami - powstajęce przez podwojenie innych genów i utracenie swojej funkcjonalności w trakcie tworzenia, ewolucji lub mutacji; jednym z mechanizmów powstawania jest niesymetryczny crossing-over
  - retropseudogeny - utworzone przez wprowadzenie do genomu retrotranskryptu - odwrotnego transkryptu cDNA (komplementarny DNA), np. przy pomocy retrowirusa. Nie posiada promotora, ani intronów.
  pseudogeny nie podlegają selekcji i dlatego zachodzi w nich akumulacja mutacji

3. Transkrypcja
   
   to enzymatyczna synteza RNA w oparciu o matrycę DNA. Transkrypcja obejmuje trzy etapy: inicjacja, elongacja i terminacja; przepisywana jest tylko jedna nić DNA (nić matrycowa = nić antysensowna). Powstający transkrypt na RNA ma sekwence nukleotydów taką samą jak niematrycowa nić DNA (nić sensowna). Synteza zachodzi w kierunku 5' do 3'

• Mechanizm transkrypcji u Prokaryota
  
  u prokaryota proces zachodzi w cytoplazmie, uczestniczy w nim tylko jeden typ polimerazy RNA (masa 5x10⁵D, zbudowana z 2 podjednostek α, β i β' oraz jednostki pomocniczej σ za pośrednictwem której łączy się z promotore (holoenzym α²ββ'σ). Podjednostka σ odłącza się od kompleksu polimerazowego gdy rozpoczyna się proces transkrypcji. Druga jednostka pomocnicza ρ (rho) uczestniczy w oddzieleniu polimerazy od DNA pod koniec transkrypcji.
  Cząsteczka polimerazy RNA luźno asocjuje z DNA a następnie szybkim ruchem ślizgowym przesuwa się wzdłuż helisy DNA aż napotka odcinek zwany promotorem, z którym tworzy silny kompleks. Promotor składa się z dwóch regionów DNA poniżej sekwencji przeznaczonej do przepisania. Pierwszy region heksamerowy (pribnow box) zawiera sekwencje TATAAT której środek leży w pozycji -10 od promotora. Drugi region kończy się pozycji -35 od promotora. Polimeraza przyłącza się na poziomie tych miejsc, transkrypcja rozpoczyna się na poziomie deoksyrybonukleotydu w pozycji 1, czyli około 8 zasad poniżej pribnow box.
  Pierwsza zasada odczytywana w pozycji +1 to tymina (czyli na RNA adenina). Polimeraza RNA rozdziela dwie nici podwójnej helisy i katalizuje przyłączanie rybonukleotydów do końca (3'OH) tworzącego się RNA (rozplataniu ulega odcinek 12-17pz.). Rozwinięty fragment DNA to bąbel transkrypcyjny. Prekursorami syntezy RNA są trifosforany rybonukleozydów - UTP, CTP, GTP, ATP.
  Terminacja zachodzi w miejscu kilkakrotnie powtarzających się sekwencji palindromowych 8-9pz. dodzielonych zasadami wtrąconymi. (AAA GGC TCC | TTTT | GGA GCC TTT) - tworzy się spinka do włosów, sygnalizująca polimerazie RNA koniec transkrypcji po kilku dodatkowych zaradach w miejscu STOP.
  

• Mechanizm transkrypcji u Eukaryota
  
  u eukaryota proces zachodzi w jądrze komórkowym, uczestniczą w nim trzy typy polimeraz RNA (transkryptazy) zależnych od DNA. Pierwszym etapem transkrypcji jest utworzenie wiązania pomiędzy DNA a polimerazą RNA na poziomie promotora. Transkrypcja umownie przebiega z lewa na prawo (w kierunku „poniżej”).
  

• Transkrypcja przy udziale polimerazy RNA I
  
  występuje w jąderku i bierze udział w transkrypcji rDNA (genów kodujących rybosomalne RNA - rRNA; powtórzone 100-5000 razy w obrębie haploidalnego genomu - człowiek 450x). Produktem transkrypcji jest cząsteczka prekursor rRNA (pre-rRNA) o stałej sedymentacji 45S; pre-rRNA dojrzewa przez metylacje transkryptu (dotyczy cytozyn i wyjątkowo ryboz) - dodanie około 100 grup metylowych. Całość tych ugrupowań odnajdujemy w dojrzałym RNA cytoplazmatycznym. metylacja odgrywa rolę protektora w stosunku do enzymów RNA-az i ułatwia rozpoznawanie sekwencji przeznaczonych do wycięcia. W trakcie dojrzewania do rRNA przyłączają się białka rybosomalne, koniec 5' prekursora zostaje odcięty i podzielony (prekursor) na ostateczne fragmenty (18S, 28S i 5,8S) Frakcje 28S i 5,8S zostają powiązane przez sparowanie zasad na poziomie 5' fragmentu 28S. Po przyłączeniu 34 białek powstaje duża podjednostka rybosomu (60S), małą podjednostkę rybosomu (40S) stanowi frakcja 18S w połączeniu z białkami rybosomalnymi. Powstałe podjednostki opuszczają jąderko i przemieszczają się do cytoplazmy.
  

• Transkrypcja przy udziale polimerazy RNA II
  
  występuje w nukleoplazmie i syntezuje prekursorowe mRNA (pre-mRNA), przyłącza się do kasety TATA. Przyłączenie polimerazy do promotora i inicjacja transkrypcji wymaga asocjacji czynników transkrypcji TF II z promotorem, czynnik TF II D (jego podjednostka TBP) wiąże się z sekwencją TATA box, przy obecności czynnika TF II A. Później wiążą się z promotorem: czynnik TF II B, polimeraza, czynniki TF II E i TF II F. Inicjacja pierści się 25-30 pz. niżej. W przypadku braku TATA box zastępuje ją GC box.
  Polimeraza II syntezuje też częściowo lub w całości snRNA uczestniczący w splicingu mRNA. Terminacja zależy od pojawienia się struktury spinki do włosów której podstawa bogata jest w GC. Bezpośrednio po rozpocząciu transkrypcji do końca 5' przytwierdza się czapeczka (jeden nukleotyd - 7-metyloguanozyny) co stanowi pierwszy etap dojrzewania mRNA, jej obecność konieczna do translacji. Transkrypt jest przecinany poniżej 20 par zasad od sekwencji AAUAAA; enzym jądrowy - polimeraza poli-A, bez użycia matrycy dołącza do 200 nukleotydów adenylowych (brak u mRNA kodujących białka histonowe) - ogon ma wpływ na stabilność mRNA
  
  Nukleosomy mogą mieć związek z transktypcją na jednym z trzech podstawowych etapów: wiązanie czynników niezbędnych dla rozponania właściwego miejsca przez polimerazę RNA i jej przyłączania, inicjacji transkrypcji oraz elongacji transktypcji. Jeśli nukleosomy ograniczają dostęp do sekwencji DNA to transkrypcja zostaje zahamowana, jeżeli jednak czynniki transkrypcji jako pierwsze połączą się z tym genem to zespół nukleosomów traci zdolność inhibicji transkrypcji. Nukleosomy mogą hamować transkrypcję tworząc lub pozwalając na tworzenie struktur wysoce upożądkowanych. Nukleosomy mogą wpływać na fazę elongacji transkrypcji, gdy polimeraza RNA rozpozna ich sekwencje promotorowe. Polimeraza RNA II może uczestniczyć w transkrypcji mimo obecności nukleosomów
  
  Na końcach intronów znajdują się sekwencje dwunukleotydowe, zwane sekwencjami zgodnymi (sekwencje konsensusu) - GU przy 5' i AG przy 3'. Szczególną rolę w splicingu odgrywają trzy sekwencje: miejsce donorowe w pozycji 5' intronu (sekw. GU), miejsce rozgałęzienia (adenina 20 zasad powyżej terminalnego końca 3' intronu - na tym poziomie zachacza się koniec 5' intronu - tworząc lasso), miejsce akceptorowe (sekw. AG). Mechanizm splicingu wymaga udziału cząsteczek rybonukleoproteinowych (snRNP) - U1, U2, U4, U5 i U6 (bogate w uracyl); mają max 300 nukleotydów - snRNA lub scRNA (small cytoplasmic RNAs) tworzą z białkami kompleksy snRNP (small nuclear Ribonucleoprotein Particeles) i scRNP. Konglomeraty snRNP i prekursorów mRNA tworzą spliceosom
  
  (detale strasznie glupie na stronie 72/73)
  

• Transkrypcja przy udziale polimerazy RNA III
  
  występuje w nukleoplazmie, uczestniczy w syntezie małych cząstek RNA (pre-tRNA, 5S rRNA). Jej transkrypty nie posiadają struktury cap = posiadają koniec trifosforan-5', zasadą terminalną jest zasada purynowa (dla 5S rRNA jest to guanina). Promotor małych RNA mieści się w części kodującej genu, ostateczna długość RNA otrzymywana przez wycinanie intronów i działanie egzonukleaz. U eukaryota tRNA ulega wielu modyfikacjom post-transkrypcyjnym np. zespoły szczególnych zasad: pseudourydynę, inozynę, dihydrourydynę, rybotymidynę, metyloguanozynę, metyloinozynę.

4. Translacja

• Rola poszczególnych rodzajów RNA w translacji

• Inicjacja translacji

• Elongacja w translacji

• Terminacja translacji

• Polisomy

• Postranslacyjne modyfikacje białek

REGULACJA EKSPRESJI GENÓW

Zapłodniona komórka jest totipotencjalna - ma nieograniczone możliwości rozwoju.

* Regulacja ekspresji genów u Prokaryota

Regulacja odbywa się na dwóch poziomach:
- transkrypcji (przez regulację liczby utworzonych cząsteczek mRNA)
- translacji ( przez regulację liczby kopii łańcuchów polipeptydowych syntezowanych przy użyciu
konkretnej cząsteczki mRNA)

Regulacja wewnętrzna to transkrypcja pod kontrolowaną stopniem oddziaływania pomiędzy polimerazą RNA i promotorem genu. Jest wynikiem długiej ewolucji promotorów i nie pozwala na adaptację poziomu syntezy białek w zależności od krótkotrwałych zmian metabolizmu komórkowego.

* Pojęcie i budowa operonu

Operon to zbiór sąsiadujących ze sobą nukleotydów, stanowiących jeden lub więcej genów, na których syntezowana jest pojedyncza cząsteczka mRNA. Każdy operon zawiera zmienną ilość przylegających do siebie genów strukturalnych (cistronów).

Operator - odpowiednik operonu, który rozpoznaje i przyłącza represor, położony bezpośrednio pod pierwszym genem struktury.

Promotor - odcinek operonu, do którego zaczyna się synteza mRNA. (posiada miejsce przyłącze-
nia cyklicznego AMP (cAMP) oraz miejsce przyłączenia polimerazy RNA)

Regulator - gen kontrolujący syntezę białek na drodze wytwarzania represora (są przepisywane konsultatywnie, nie podlegają indukcji i represji

Represor - reguluje na poziomie transkrypcji, blokuje transkrypcję danego genu przez związanie się z operatorem. Takie połączenie uniemożliwia polimerazie RNA przyłączanie się do promotora i przemieszczanie wzdłuż genu = blokuje transkrypcję! Regulację działania represora regulują inhibitory i korepresory (zmieniają konformację represora i ich powinowactwo do sekwencji regulatorowej)

* Rola efektorów w regulacji aktywności operonów.

Represory to białka allosteryczne (allosteria = zdolność białek do zmiany konformacji w wyniku przyłączenia efektora allosterycznego > zmiana właściwości białka). Efektory przyłączają się do centrum allosterycznego (w innym miejscu niż centrum aktywne represora). Efektorami allosterycznymi mogą być aminokwasy, hormony steroidowe. Wiązania między białkami a efektorami są słabe, oddysocjowanie efektora zależy od jego stężenia.. Regulacja ekspresji genów za pomocą allosterycznych białek regulacyjnych polega na blokowaniu lub uniemożliwieniu transkrypcji (reg. pozytywna = do odblokowania transkrypcji potrzebny jest dodatkowy czynnik np. laktora) (reg. negatywna = blokowanie transkrypcji przez wolny represor)

* Regulacja szlaków katabolicznych i anabolicznych

Istnieją dwa typy operonów: indukowane (kataboliczne) i ulegające represji (anaboliczne). Szybkość transkrypcji podlega autoregulacji - produkt genu może odgrywać rolę represora, np. transkrypcja genów kodujących rRNA.
Enzymy uczestniczące w degradacji (katabolizmie) danej substancji są produkowane jedynie wtedy gdy substancja ta jest obecna w komórce lub otaczającym ją środowisku.
Enzymy uczestniczące w synteze (anabolizmie) produkowane są gdy substancja nie istnieje w komórce lub jej otoczeniu.

* Operator laktozowy E.coli (E.Jacob i J. Monod w 1961r.)

Synonim: lac ZYA. Składa się z trzech genów struktury kodujących:
- β-galaktozydazę (lac Z) - hydrolizuje laktozę do galaktozy i glukozy,
- permeazę β-galaktozydową (lac Y) - reguluje transport laktozy przez błonę komórkową bakterii,
- transacetylazę β-galaktozydową(lac A) - reguluje transport laktozy wewnątrz komórki
Represor wiążąc się z operatorem uniemożliwia przyłączanie polimerazy RNA do promotora = blokuje transkrypcję genów Z, Y, A. Laktoza wiąże się z represorem powodując, jego odłączenie od operatora = początek transkrypcji. W ten sposób laktoza powoduje derepresję (odblokowanie) operonu ZYA

Represja kataboliczna = związanie polimerazy RNA z promotorem za pośrednictwem pomocniczej jednostki
σ-czynnika, który zwiększa powinowactwo polimerazy RNA do promotora. Białko aktywatorowe CAP może się przyłączyć do DNA tylko w obecności cAMP. Gdy poziom glukozy jest wysoki, poziom cAMP jest niski.

* Operator tryptofanowy u E. coli

Synonim: trp. Składa się z 5 genów struktury kodujących enzymy do syntezy tryproganu. Jest to operon anaboliczny. Białko regulatorowe tego operonu jest kodowane przez gen regulatorowy R, zlokalizowany w pewnej odległości od operonu trp. Białko regulatorowe tworzy kompleks z tryptofanem (korepresorem) i w tej formie łączy się z operonem. Jest to regulacja pozytywna

* Atenuacja (osłabienie)

Atenuacja jest uzupełniającym systemem regulacji peronów represyjnych, polega na kontroli trankrypcji przez translację

* Mechanizmy regulacji ekspresji genów u Eukaryota

U eukaryota nie istnieje ogólny model regulacji w postaci operonów.

* Regulacja ekspresji na poziomie matrycy DNA - chromatynowe otoczenie genów aktywnych

DNA może istnieć w trzech formach:
- forma I (superzwinięta) - naprężenia wywołane dodatkowymi obrotami; DNA w kształcie warkocza
- forma II - rozluźniona, kształt kolisty; otrzymywane in vitro przez cięcie jednej nici
- forma III - liniowa postać DNA; otrzymywana przez przecięcie dwóch nici

Zmienność stopnia skręcenia DNA jest czynnikiem modyfikującym dostęp białek do promotora, regulując w ten sposób ekspresję. Forma superzwinięta zapewnia największy dostęp białkom. Mutacje w genach odpowiedzialnych za syntezę topoizomeraz (enzymy odpowiedzialne za tworzenie/usuwanie superzwojów), wpływają na zmniejszenie transkrypcji genów. Obszar DNA otaczający gen ulegający ekspresji nazwano domeną funkcyjną. Region domeny moża określić trawiąc oczyszczoną chromatynę DNA-zą I, wyszukującej wyeksponowanych stref DNA w chromatynie.

* Miejsca wrażliwe na DNA-zę 1

Miejsca wrażliwe odpowiadają genom aktywnym oraz te które kiedyś pełniły funkcje takich genów (geny płodowe) np. α-fetoproteiny w jądrach kom. wątrobowych. Skutkiem różnicowania komórkowego jest umieszczanie genów przeznaczonych do transktypcji w szczególnej (dostępnej) konformacji przestrzennej. Z tego powodu powinowactwo białka regulatorowego do takiego genu jest obniżone. Specyficzna przestrzenna struktura jest najwyższym poziomem regulacji (selekcja genów przeznaczonych do transkrypcji)

* Miejsca nadwrażliwe na DNA-zę 1

W miejscach tych nie ma nukleosomów i dlatego białka wiążące mają łatwy dostęp do DNA. W tych miejscach DNA-za 1 dokonuje tylko kilku cięć, w precyzyjnie określonych sekwencjach (zachowanie podobne do enzymów restrykcyjnych). Najczęściej zlokalizowane na poziomie nieprzepisywanych regionów 5' (promotory genów aktywnych), czasami również w regionie 3'

* Regulacja ekspresji na drodze metylacji

Metylacja to enzymatyczne przyłączenie reszt metylowych -CH3 do nukleotydów. Reakcje kontroluje metylotransferaza DNA, u eukaryota tylko cytozyny w pozycji C5' [jedynie cytozyny wchodzące w skład dinukleotydu CpG], (u prokaryota adeniny i cytozyny). Metylacja wiąże się ze zmniejszeniem aktywności transkrypcyjnej danych genów. W DNA komórek nowotworowych hipometylacja. Metylacja wiąże się ze zmniejszeniem stopnia acetylacji histonów, czyli indukuje powstawanie bardziej upakowanych struktur chromatyny w metylowanych rejonach chromosomowego DNA. Metylacja = wyłączenie funcji genu(chromosom X, za wyjątkiem HPRT). Metylacja jest odwracalna, dzięki niej możliwe jest precyzyjne włączanie i wyłączanie określonych sekwencji genów. Proces demetylacji odgrywa rolę w procesie aktywacji promotorów (protoonkogenów).
Metylacja występuje natychmiast po replikacji w miejscach komplementarnych do zmetylowanych cytozyn nici DNA służącej za matrycę. Sekwencja CpG jest palindromowa. DNA pochodzący od matki podlega bardziej nasilonej metylacji niż ten pochodzący od ojca.

* Regulacja ekspresji na poziomie transkrypcji

Podobna lecz bardziej złożona niż u Prokaryota. Eukaryota mogą zmieniać wykorzystanie jednej i tej samej sekwencji przez przyłączenie różnych białek regulatorowych.

* Białka regulatorowe = czynniki transkrypcyjne

Zdolne są przyłączyć się do DNA do specyficznych sekwencji i mogą regulować poziom transkrypcji dodatnio lub ujemnie. Białka regulatorowe kodowane są przez geny regulatorowe (5-10% genomu). Czynniki transkrypcyjne mają budowę modularną i składają się z domen białkowych:
- domeny wiążące DNA
- domeny odpowiedzialne za dimeryzację
- domeny transaktywujące
Domeny wiążące i odpowiedzialne za dimeryzację zawierają struktury białkowe zwane motywami. Na podstawie zawartych w nich motywów wyróżnia się trzy typu domen wiążących (domena helisa-zwrot-helisa, domena palce cynkowe i domena zasadowa (suwak leucynowy + helisa-pętla-helisa)). W domenach odpowiedzialnych za dimeryzację wyróżnia się dwa typy motywów (suwak leucynowy i helisa-pętla-helisa)

* Typowe struktury uczestniczące w interakcji białek regulatorowych z DNA

- motyw helisa-zwrot-helisa (HTH) - na poziomie miejsca wiązania białko HTH posiada dwa krótkie fragmenty tworzące helisę, rozdzielone małym odcinkiem tworzącym „zwrot”. Helisa rozpoznawcza może lokalizować w cząsteczce DNA specyficzne zasady i łączyć się z nimi. HTH łączy się z DNA słabymi wiązaniami wodorowymi (lub Van der Waalsa). W momencie połączenia obie cząsteczki ulegają zmianom konformacyjnym.

- motyw palców cynkowych - zawiera atom cynku, otoczony czterema aminokwasami; wyróżniamy dwa typy: Cys₂His₂ (atom cynku otoczony dwiema cząsteczkami cysteiny i dwiema histydyny) oraz Cys₄. Motyw palca cynkowego jest powtórzony wiele razy w domenie wiążącej DNA (do związania DNA potrzeba minimum trzech), zawiera aminokwasy zasadowe, oddziaływjące z DNA przez duży rowek podwójnej helisy DNA. Przykładem jest czynnik transkrypcyjny Sp1 (3 palce cynkowe typ Cys₂His₂) i GATA (GATA-1 - rozwój linii erytrocytarnej; GATA-2 - megakariocytarnej; GATA-3 - limfocytów T)

- motyw suwak leucynowy - posiada leucynę w co siódmej pozycji z obrębie ok. 35 reszt aminokwasowych motywu białka regulatorowego. Jego białka tworzą dimery złożone z dwóch skręconych z sobą łańcuchów o strukturze superhelisy α. Regularny szereg leucyn wewnątrz superhelisy stabilizuje strukturę za pomocą wiązań hydrofobowych i oddziaływań van der Waalsa. Serie leucyn mogą oddziaływać z innymi, podobnymi seriami leucyn, znajdującymi się w innej cząsteczce białka, ułatwiając dimeryzację danych białek (hetero- lub homodimery) - w nich domeny wiążące z DNA (30 aminokw.) znajdują się bliżej końca aminowego. Motyw obecny w białkach Jun i Fos uczestniczące w kontroli proliferacji komórek, w białku C/EBP - wiążącym sekwencję wzmacniającą transktypcję, w białku CREB - wiążącym element odpowiedzi na cAMP.

- motyw helisa-pętla-helisa

* Regulacja ekspresji genu w pozycji cis i trans

* Szczególny mechanizm regulacyjny wybranych genów

* Regulacja postranskrypcyjna

---