Laboratoryjna diagnostyka pasożytów opiera się na następujących zasadach:

-Właściwy wybór materiału do badania bezpośredniego i pośredniego

-Właściwy wybór diagnostycznej metody badania danego materiału (zagęszczanie, utrwalanie, barwienie)

-Znajomość stadiów rozwojowych pasożyta mogących występować w badanym materiale oraz znajomość cech gatunkowych pasożyta

-Wykluczanie określonej inwazji pasożytniczej dopiero po kilkakrotnym (co najmniej 3-krotnym) badaniu materiału.

Materiał diagnostyczny Tkanki, Płyny ustrojowe, Wydaliny i wydzieliny

Najczęściej bada się: Kał, Krew, Wydzielinę pochwową , Treść dwunastnicy, Ślinę, plwocinę, Zeskrobiny błon śluzowych, Płyn mózgowo-rdzeniowy, Materiał z punkcji i biopsji, Wycinki tkanek pobrane przyżyciowo lub w czasie sekcji

Metody bezpośrednie Stosuje się je w celu stwierdzenia obecności pasożyta w badanym materiale i określenia jego przynależności gatunkowej. Obejmują on

Preparaty bezpośrednie - np. rozmazy kału, krwi, przyżyciowe lub barwione po utrwaleniu

-Metody zagęszczające pasożyty - np. sedymentacyjne,

-Metody hodowlane - polegające na namnażaniu pasożyta na podłożach sztucznych lub w ciele zwierząt laboratoryjnych.

Metody pośrednie

• Swoiste - celem ich jest wykazanie reakcji immunologicznej ze strony żywiciela, będącej odpowiedzią na inwazję pasożytniczą (np. oznaczanie poziomu przeciwciał w surowicy krwi).

• Nieswoiste - obejmują one badania hematologiczne, histologiczne, histopatologiczne, radiologiczne lub USG, których wyniki np. eozynofilia krwi mogą pośrednio świadczyć o inwazji pasożytniczej.

Badania koproskopowe. Przy pobieraniu kału należy przestrzegać następujących zasad:

• Kał pobierać do czystych, suchych naczyń lub na czysty papier a następnie (najlepiej całą wydaloną porcję) przenosić do naczyń odpowiednich do transportu. •Po podaniu środków przeczyszczających pobierać kał w kolejnych porcjach do ponumerowanych naczyń i bezpośrednio dostarczyć do laboratorium. •Chronić kał przed zamarznięciem. •Normalny kał pobierać do badania co najmniej 2-3 krotnie, w odstępach kilkudniowych. Jeżeli wyniki badań są ujemne, pobrać kał po podaniu środków przeczyszczających.

Płyny utrwalające

• Formalina 5% i 10% - trwale konserwuje jaja, larwy robaków i cysty pierwotniaków, nie konserwuje trofozoitów.

• PVA (utrwalacz poliwinylowy) - konserwuje jaja, larwy robaków oraz trofozoity i cysty pierwotniaków. Jest trwały i odpowiedni do barwienia różnymi metodami. Odczynnikiem tym utrwalać można nie tylko cały materiał diagnostyczny, ale również rozmazy, które barwi się bezpośrednio lub po pewnym czasie hematoksyliną.

• MJF (roztwór mertiolatu, jodu i formaliny) - konserwuje jaja, larwy oraz trofozoity. Jest nieodpowiedni do sporządzania preparatów trwałych barwionych.

• PAF (roztwór fenolu, alkoholu i formaliny) - charakteryzuje się podobnymi właściwościami jak MJF.

Makroskopowe badanie kału

• Materiał diagnostyczny umieszcza się w zlewce lub na płytce Petriego, rozcieńcza wodą i dekantuje

• Pasożytów poszukuje się w osadzie za pomocą lupy i igieł preparacyjnych lub cedzi się zawiesinę kału przez gazę lub sitka

• Wyizolowane z kału robaki bada się najpierw gołym okiem lub za pomocą lupy w płynie fizjologicznym

• W celu uwidocznienia szczegółów budowy anatomicznej nicieni dodaje się do wody barwniki np. czerwień obojętną, błękit metylenowy

• Przywry i człony tasiemców z rodziny Taenidae należy przed badaniem spłaszczyć, umieszczając je między dwoma szkiełkami podstawowymi

• Preparat można prześwietlić wprowadzając między szkiełka parę kropli 5% kwasu octowego lub gliceryny

• W razie problemów z ustaleniem przynależności gatunkowej pasożyta wykonuje się preparaty trwałe

• Przed utrwaleniem robaki płucze się w ciepłym roztworze fizjologicznym NaCl lub przechowuje w chłodni w celu rozkurczenia wora skórno - mięśniowego.

• Barwnik na ogół słabo przenika przez oskórek nicieni, dlatego utrwalonych okazów zazwyczaj się nie barwi, tylko prześwietla, np. w ksylenie lub olejku cedrowym i zamyka w balsamie kanadyjskim.

• Robaki płaskie utrwala się w płynie Bouina lub mieszaninie alkoholu i formaliny, umieszczając je w butelce z utrwalaczem lub rozciągając między szkiełkami podstawowymi, między które wkrapla się utrwalacz pipetą.

• Czas utrwalania zależnie od grubości preparatu wynosi 0,5-3h

• Utrwalone okazy można przechowywać w 70% alkoholu lub sporządzać z nich preparaty trwałe barwione

• Do barwienia robaków płaskich używa się : karminu ałunowego (małe przywry i proglotydy tasiemców), karminu boraksowego (większe przywry i tasiemce), karminu z kwasem mlekowym (tasiemce) oraz hematoksyliny ałunowej lub kwaśnej (mniejsze robaki).

• Po zabarwieniu preparaty odwadnia się w szeregu alkoholi o wzrastających stężeniu aż do alkoholu absolutnego, prześwietla w ksylenie, olejku goździkowym lub cedrowym i zamyka w balsamie kanadyjskim.

• Robaki obłe utrwala się w płynie Barbagallo, mieszaninie alkoholu z glicerolem (drobne nicienie), płynie Zenkera, w ciepłej 5-10% formalinie z dodatkiem gliceryny (duże nicienie), w ciepłym 70% alkoholu lub wodnym roztworze gliceryny.

• Celem tych badań jest wykrycie trofozoitów i cyst pierwotniaków oraz jaj, larw i postaci dojrzałych robaków pasożytniczych. Zwraca się również uwagę na komórki żywiciela i pewne twory, których obecność może być związana z inwazją pasożytniczą np. erytrocyty świadczące o owrzodzeniach lub zmianach krwotocznych i naczyniowych, makrofagi świadczące o infekcji.

Mikroskopowe badanie kału w kierunku pierwotniaków

• Rozmaz świeżego kału:

• preparat mokry niebarwiony

• preparat mokry podbarwiony (1% płyn Lugola, odczynnik Quensela)

• preparat trwały barwiony

Gatunki pierwotniaków, które mogą występować w kale

• Lamblia intestinalis - trofozoity i cysty

• Chilomastix mesnili - trofozoity i cysty

• Enteromonas hominis - trofozoity i cysty

• Retortamonas intestinalis - trofozoity i cysty

• Isospora hominis - oocysty

• Isospora belli - oocysty

• Entamoeba histolytica - trofozoity i cysty

• Entamoeba coli - trofozoity i cysty

• Entamoeba hartmanni - trofozoity i cysty

• Entamoeba polecki - trofozoity i cysty

• Endolimax nana - trofozoity i cysty

• Dientamoeba fragilis - trofozoity

• Iodomoeba bütschlii - trofozoity i cysty

• Balantidium coli - trofozoity i cysty

Mikroskopowe badanie kału w kierunku robaków pasożytniczych

• Badać można zarówno kał świeży, jak i utrwalony w płynach konserwujących

• W badaniach helmintologicznych stosuje się najczęściej:

• rozmaz bezpośredni

• gruby rozmaz kału

• metodę Kato i Miura

• metody zagęszczające

• wymazy z odbytu i odbytnicy

• metody hodowli i izolowania larw z kału

• ilościowe metody koproskopowe

Gruby rozmaz kału Około 50 mg kału miesza się na szkiełku podstawowym z kroplą płynu fizjologicznego lub wody, rozmazuje na powierzchni 2 x 4 cm, po czym suszy w cieplarce. Preparat bada się w małym powiększeniu mikroskopu, w kropli oleju parafinowego, który rozjaśnia obraz.

Metoda Kato i Miura 40-60 mg kału umieszcza się za pomocą igły preparacyjnej na czystym szkiełku podstawowym i przykrywa skrawkiem celofanu, wymoczonego uprzednio w ciągu 24 godzin w roztworze zawierającym wodę, glicerol i zieleń malachitową. Następnie za pomocą gumowego korka rozgniata się kał do odpowiednio grubego rozmazu i po godzinie w temperaturze pokojowej lub po 20-30 minutach w cieplarce bada się preparat w słabym powiększeniu mikroskopu.

Metody zagęszczające

• Sedymentacyjne- Polegają na zanurzeniu badanego materiału w płynach o mniejszym ciężarze własnym, niż ciężar jaj, larw robaków i cyst pierwotniaków.

• Flotacyjne- W metodach tych stosuje się płyny o większym ciężarze właściwym, niż ciężar cyst, jaj i larw, które w wyniku tego wypływają i gromadzą się na powierzchni płynu, skąd łatwo je pobrać do badania.

Metody zagęszczające sedymentacyjne

• Sedymentacja z kwasem i eterem (Telemanna)

• Sedymentacja z formaliną i eterem (Ritchie)

• Sedymentacja z odczynnikiem MJF

Metody zagęszczające flotacyjne

• Flotacja z roztworem chlorku sodu (Fülleborna)

• Flotacja z roztworem siarczanu cynku (Fausta)

Wymazy z odbytu i odbytnicy

• Wymazy należy wykonywać wcześnie rano lub późnym wieczorem, przed myciem i wypróżnieniem. Badanie przeprowadza się bezpośrednio po pobraniu materiału, a w przypadku jeśli nie jest to możliwe, można wymazy przez kilka dni, a nawet tygodni przechowywać w lodówce. Metodą wymazów wykrywa się jaja Enterobius vermicularis i Taenia sp.

• Metoda przylepca celofanowego (Grahama)

Przezroczysty przylepiec celofanowy o długości 10 cm i szerokości 2 cm przykłada się lepką stroną w okolicy odbytu tak, aby uzyskać wymaz śluzu fałdów odbytniczych. Następnie taśmę przykleja się do szkiełka podstawowego i ogląda w małym powiększeniu mikroskopu.

• Metoda pałeczki szklanej z celofanem (NIH)

Przygotowuje się pałeczki szklane z zaokrąglonym końcem, na którym owija się i przymocowuje gumką kawałek celofanu. Przeciwległy koniec wkłada się do korka i umieszcza w probówce. Ruchem obrotowym pałeczki wymazuje się dokładnie fałdy skóry i błony śluzowej odbytu. W laboratorium zdejmuje się pęsetą celofan z pałeczki, rozprostowuje między dwoma szkiełkami podstawowymi i ogląda w małym powiększeniu mikroskopu w kropli glicerolu z wodą.

Formy rozwojowe robaków pasożytniczych, które można wykryć badaniem mikroskopowym w kale

• Fasciola hepatica - jaja

• Fasciolopsis buski - jaja

• Dicrocoelium dendriticum - jaja

• Opisthorchis felineus - jaja

• Clonorchis sinensis - jaja

• Paragonimus westermani - jaja

• Schistosoma haematobium - jaja

• Schistosoma mansoni - jaja

• Schistosoma japonicum - jaja

• Diphyllobothrium latum - jaja

• Dipylidium caninum - torebki maciczne

• Taenia saginata - jaja

• Taenia solium - jaja

• Hymenolepis diminuta - jaja

• Hymenolepis nana - jaja

• Ascaris lumbricoides - jaja

• Trichuris trichiura - jaja

• Enterobius vermicularis - jaja

• Strongyloides stercoralis - larwy

• Ancylostoma duodenale - larwy, jaja

• Necator americanus - jaja, larwy

Diagnostyka parazytologiczna pasożytów krwi

• Preparat bezpośredni

• Cienki rozmaz krwi

• Gruby rozmaz krwi

Preparat bezpośredni

• Świeżą kroplę krwi przykrywamy szkiełkiem nakrywkowym i oglądamy pod mikroskopem, zaczynając od małego powiększenia przez średnie i duże. W preparacie bezpośrednim poszukuje się świdrowców łatwo dostrzegalnych dzięki ich ruchowi.

Cienki rozmaz krwi

Kroplę krwi umieścić na brzegu suchego, odtłuszczonego szkiełka. Drugie szkiełko, większe od pierwszego o szlifowanej krawędzi przykłada się pod kątem około 30^o, tak aby krawędź dotykała kropli, która po chwili rozpływa się na całej jej długości. Jednym zdecydowanym ruchem przesuwa się szkiełko pomocnicze w kierunku drugiego brzegu szkiełka podstawowego, uzyskując równomierny rozmaz krwi.

Gruby rozmaz krwi

• 2-3 krople pobrane na szkiełko podstawowe łączy się ze sobą i rozmazuje na powierzchni około 1 cm². Następnie miesza się krew przez 30 sekund, wykonując ruchy obrotowe szkiełkiem, aby nie dopuścić do wytrącenia się włóknika. Gruby rozmaz pozwala na 15-20 -krotne zagęszczenie pasożytów na tej samej powierzchni w porównaniu z rozmazem cienkim.

Barwienie rozmazów krwi

• Metoda Giemsy

• Metoda Wrighta

• Metoda barwienia oranżem akrydyny

• Metoda barwienia zielenią metylową i pironiną

Metody immunologiczne

• Polegają na wykazaniu reakcji immunologicznych ze strony gospodarza jako odpowiedzi na zarażenie. Pasożyty i ich produkty metabolizmu działając jako bodźce antygenowe mogą wyzwalać reakcje odpornościowe zarówno humoralne, jak i typu komórkowego.

• Odczyny serologiczne polegające na wykrywaniu swoistych przeciwciał, prócz wartości diagnostycznej, mają duże znaczenie w dociekaniach epidemiologicznych. Szczególną wagę mają testy serologiczne o wysokim stopniu swoistości w badaniach epidemiologicznych na obszarach o słabym nasileniu endemii pasożytniczej.

1. Reakcje serologiczne z udziałem dopełniacza

- odczyn wiązania dopełniacza (OWD)

- odczyn lityczny (odczyn Sabina-Feldmana - OSF)

2. Odczyn aglutynacji bezpośredniej

3. Aglutynacja pośrednia lub bierna

4. Odczyn hemaglutynacji - OH

5. Odczyn immunofluorescencji pośredniej (OIF)

6. Test ELISA (Enzyme - Linked - Immunosorbent - Assay)

7. Immunodyfuzja, immunoelektroforeza

8. Odczyny skórne

OWD •Odczyn wiązania dopełniacza stosuje się do wykrywania swoistych przeciwciał w badanej surowicy przy użyciu znanego antygenu. Odczyn ten jest wykonywany w dwóch fazach. W fazie pierwszej łączy się badaną surowicę ze znanym antygenem. Jeżeli w surowicy znajdują się swoiste dla danego antygenu przeciwciała, to powstaje kompleks antygen-przeciwciało, który wiąże dodany dopełniacz.

Jeżeli w badanej surowicy brak swoistych przeciwciał, to kompleks antygen-przeciwciało nie powstaje i dopełniacz pozostaje w stanie wolnym.

• W fazie drugiej do układu antygen-przeciwciało-dopełniacz dodaje się układ wskaźnikowy krwinka czerwona-hemolizyna. Jeżeli dopełniacz został uprzednio związany przez kompleks antygen-przeciwciało, to hemoliza krwinek nie wystąpi. Wynik będzie wówczas dodatni.

Jeżeli natomiast w badanej surowicy nie będzie poszukiwanych przeciwciał, to kompleks antygen-przeciwciało nie powstanie. Wolny dopełniacz zwiąże się z układem wskaźnikowym krwinka czerwona -hemolizyna, co spowoduje hemolizę. Wynik będzie wówczas ujemny.

• Dopełniacz - czyli komplement, jest to nieswoisty składnik krwi zwierząt stałocieplnych, bardzo wrażliwy na temperaturę. Unieczynnia (inaktywuje) się go przez ogrzewanie 30 min. w temp. 56^oC. Powoduje rozpuszczanie bakterii (bakteriolizę) związanych ze swoistym przeciwciałem, a także rozpuszczanie czerwonych krwinek (hemolizę) związanych ze swoistym przeciwciałem przeciwko tym krwinkom - tzw. hemolizyną, inaczej amboceptorem.

Test ELISA

• Jest to próba wykonywana zwykle w fazie stałej. Stosowane w niej enzymy powinny być łatwo rozpuszczalne, stabilne, łatwo łączyć się z białkiem, nie występować lub występować jedynie w minimalnych ilościach w płynach biologicznych, a ich substraty muszą być łatwo dostępne i dawać wyraźną barwę. Do najczęściej używanych należą: peroksydaza chrzanowa i fosfataza zasadowa. Ich substratami są odpowiednio o-dionizydyna lub kwas 5-aminosalicylowy i para-nitrofenylofosforan sodowy.

Test barwny Sabina - Feldmanna

• Test wykorzystuje zmiany w cytoplazmie żywych trofozoitów toksoplazm wywołane działaniem przeciwciał obecnych w surowicy krwi osobnika chorego, które stają się dobrze widoczne po wybarwieniu toksoplazm silnym roztworem błękitu metylowego.

• Komórki pasożyta namnaża się przez 48 godzin w wysięku otrzewnowym myszy, miesza ze wzrastającymi rozcieńczeniami badanej surowicy oraz aktywatorem i inkubuje w temp. 37^oC.

• Po upływie godziny dodaje się alkalicznego roztworu błękitu metylowego i ogląda w wilgotnych preparatach w mikroskopie świetlnym w dużym powiększeniu lub stabilizuje reakcję 0,4% roztworem formaliny, a wynik odczytuje w mikroskopie kontrastowo-fazowym.

• Pasożyty nie uszkodzone silnie wybarwiają się na niebiesko, w przeciwieństwie do uszkodzonych , które nie ulegają zabarwieniu

• W reakcji dodatniej większość pasożytów ulega lizie i nie barwi się. Miano surowicy dodatniej określa to rozcieńczenie surowicy, przy którym stosunek organizmów zabarwionych do bezbarwnych wynosi 1:1 /dawka śmiertelna dla 50% pasożytów/.

---