Chemia kliniczna - WYKŁAD IX 10.12.2010r.

1. Badania laboratoryjne w ocenie zaburzeń gospodarki lipidowej

• Badania skriningowe:

- stężenie cholesterolu całkowitego

- test zimnej flotacji (ocena wizualna surowicy)

• Badania podstawowe:

- stężenie cholesterolu całkowitego

- stężenie triglicerydów

- stężenie cholesterolu HDL

- stężenie cholesterolu LDL

• Badania kierunkowe:

- rozdział elektroforetyczny lipoprotein

- stężenie Lp (a)

- stężenie apo AI, apo B

2. Badania laboratoryjne w ocenie zagrożenia rozwojem miażdżycy

• Dodatkowe badania specjalistyczne:

- fenotypy LDL

- badanie receptorów dla LDL

- stężenie oksydowanych LDL

- fenotypy apo E

- stężenie homocysteiny

- hsCRP

- metody biologii molekularnej

3. Badania laboratoryjne w ocenie zaburzeń gospodarki lipidowej

Przygotowanie pacjenta do badań

• 12-14 h na czczo przed pobraniem krwi

• przestrzegać stałej diety ze zwyczajową zawartością tłuszczów w okresie 2 tygodni przed badaniem

• odstawienie leków zmniejszających stężenie lipidów we krwi

Pobieranie i przechowywanie krwi

• standardowy sposób pobierania krwi (pozycja siedząca, krótkotrwałe stosowanie stazy)

• krew żylna pobierana „na skrzep” (surowica) lub na EDTA (osocze)

• szybkie odwirowanie surowicy lub osocza

• surowicę/osocze do oznaczania lipidów można przechowywać:

- w temp. +4^oC do 3-4 dni

- w temp. - 20^oC do 6 miesięcy

- w temp. -70^oC do 1 roku

• surowicy/ osocza do oznaczania lipoprotein nie należy zamrażać

4. Oznaczanie cholesterolu

Metody chemiczne - reakcje barwne

1) Reakcja Liebermanna - Burcharda (reakcja zielona)

• cholesterol w obecności bezwodnika kwasu octowego i stężonego kwasu siarkowego przekształca się w substancję barwną

• substancje interferujące: bilirubina, witaminy, steroidy

2) Reakcja z chlorkiem żelazowym (reakcja czerwona)

• cholesterol w obecności kwasu octowego lodowatego, stężonego kwasu siarkowego i chlorku żelazowego daje czerwone zabarwienie

• substancje interferujące: bilirubina

Metody enzymatyczne oznaczania cholesterolu

- Metoda CHOD - PAP

1. Hydroliza estrów cholesterolu

estry cholesterolu + H₂O cholesterol wolny + kwasy tłuszczowe

2. Utlenianie cholesterolu wolnego

cholesterol + O₂ cholestenon + H₂O₂

3. Reakcja barwna:

rozkład H₂O₂ w obecności peroksydazy, utlenianie 4-aminoantypiryny (4-AAp, 4-aminofenazon), tworzenie sprzężonych połączeń 4-AAP z fenolem ( pochodne chinoiminy)

4-AAP + 2 H₂O₂ + chlorofenol pochodna chinoiminy + 4 H₂O

5. Zwiększone stężenie cholesterolu

• Hiperlipidemie pierwotne

- pospolita hipercholesterolemia

- rodzinna hipercholesterolemia

- rodzinna złożona hiperlipidemia

- rodzinna dysbetalipoproteinemia

• Hiperlipidemie wtórne

- choroby wątroby

* żółtaczki pozawątrobowe

* pierwotna żółciowa marskość wątroby

- choroby nerek

* zespół nerczycowy

* przewlekła niewydolność nerek

- cukrzyca

- niedoczynność tarczycy

- otyłość

- leki: betablokery, diuretyki tiazydowe, kortykosterydy, androgeny

6. Obniżone stężenie cholesterolu

• choroby wątroby

- zaawansowana marskość wątroby

- ostra i podostra martwica wątroby

- toksyczne uszkodzenie wątroby

- infekcje związane z uszkodzeniem wątroby

• nadczynność tarczycy

• głodzenie

• posocznica

• niedokrwistość

7. Metody oznaczania triglicerydów

Metody enzymatyczne

- test barwny

- test w ultrafiolecie (test optyczny Warburga)

8. Oznaczanie triglicerydów - metody enzymatyczne

1. Hydroliza triglicerydów w obecności lipazy

triglicerydy + H₂O glicerol + kwasy tłuszczowe

2. Fosforylacja glicerolu w obecności kinazy glicerolowej

glicerol + ATP 3- fosfoglicerol + ADP

3. Reakcja wskaźnikowa: test barwny test w ultrafiolecie

Test barwny

1. Hydroliza triglicerydów w obecności lipazy

triglicerydy + H₂O glicerol + kwasy tłuszczowe

2. Fosforylacja glicerolu w obecności kinazy glicerolowej

glicerol + ATP 3- fosfoglicerol + ADP

3. Utlenianie 3-fosfoglicerolu

3-fosfoglicerol + O₂ fosforan dihydroksyacetonu + H₂O₂

4. Oznaczanie nadtlenku wodoru

4-aminoantypiryna + 2 H₂O₂ + chlorofenol pochodna chinoiminy + 4 H₂O

Test w ultrafiolecie

1. Hydroliza triglicerydów w obecności lipazy

triglicerydy + H₂O glicerol + kwasy tłuszczowe

2. Fosforylacja glicerolu w obecności kinazy glicerolowej

glicerol + ATP 3- fosfoglicerol + ADP

3. Fosforylacja ADP

ADP + fosfoenolopirogronian pirogronian + ATP

4. Redukcja pirogronianu połączona z testem optycznym Warburga

pirogronian + NADH + H⁺ mleczan + NAD⁺

9. Zwiększenie stężenia triglicerydów

• Hiperlipidemie pierwotne:

- pospolita hipertriglicerydemia

- rodzinna hipertrigicerydemia

- rodzinna złożona hiperlipidemia

- rodzinna dysbetalipoproteinemia

- zespół chylomikronemii

• Hiperlipidemie wtórne:

- otyłość

- cukrzyca

- niedoczynność tarczycy

- zespół nerczycowy

- niedomoga nerek

- zapalenie trzustki

- leki: niektóre betablokery, diuretyki tiazydowe

10. Oznaczanie fosfolipidów - metody enzymatyczne

1. Hydroliza fosfolipidów w obecności fosfolipazy

fosfolipidy + H₂O cholina + kwas fosfatydowy

2. Utlenianie choliny w obecności oksydazy cholinowej

cholina + 2O₂ + H₂O betaina + 2H₂O₂

3. Oznaczanie nadtlenku wodoru w obecności peroksydazy

4-aminoantypiryna + 2 H₂O₂ + chlorofenol pochodna chinoiminy + 4 H₂O

11. Metody frakcjonowania lipoprotein

1) separacja przez ultra wirowanie

2) metody elektroforetyczne

3) metody wytrąceniowe

4) metody bezpośrednie

12. Rozdział frakcji lipoproteinowych poprzez ultrawirowanie

13. Elektroforeza lipoprotein

esteraza cholesterolowa (CHE)

oksydaza cholesterolowa (CHOD)

peroksydaza (POD)

lipaza

kinaza glicerolowa

lipaza

kinaza glicerolowa (GK)

oksydaza fosfoglicerolowa (GPO)

peroksydaza (POD)

lipaza

kinaza glicerolowa (GK)

kinaza pirogronianowa (PK)

dehydrogenaza mleczanowa (LDH)

fosfolipaza D

oksydaza cholinowa

peroksydaza (POD)

---