Chemia kliniczna - wykład 3.01.11

Współczesne badania laboratoryjne w ocenie zagrożenia miażdżycą

1. Badania podstawowe:

-stężenie cholesterolu całkowitego

-stężenie triglicerydów

-stężenie cholesterolu HDL

-stężenie cholesterolu LDL

• Kierunkowe

- rozdział elektroforetyczny lipoprotein

- stężenie Lp(a)

- stężenie apo AI, apo B

• Specjalistyczne:

- fenotypy LDL

- badanie receptorów dla LDL

- stężenie oksydowanych LDL

- fenotypy apo E

- stężenie homocysteiny

- hsCRP

- metody biologii molekularnej

2. Lipoproteina a

• Gęstość 1055-1100 g/l

• Skład lipidowy:

- estry cholesterolu 32%

- cholesterol wolny 7%

- fosfolipidy 23%

- triglicerydy 9%

• Apoproteiny : apo B100 i apo (a)

• Apo (a) wykazuje duże podobieństwo do plazminogenu

3. Struktura Lp (a) - rysunek

4. Izoformy Lp (a) - rysunek

- mała

- duża

5. Cechy Lp (a):

• Stężenie Lp(a) w surowicy: 0-100mg/dl

• Lp (a) zaliczono do niezależnych czynników ryzyka choroby niedokrwiennej serca

• Stężenie > 30mg/dl (0,3 g/l) koreluje dodatnio z częstości występowania niedokrwiennej choroby serca

• Stężenie Lp (a) jest zdeterminowane genetycznie i nie jest związane z dietą, aktywnością fizyczną i lekami przeciwlipidowymi

• Na poziom Lp (a) niewielki wpływ mają pochodne kwasu nikotynowego oraz estrogeny

• Lp(a) może być wskaźnikiem ostrej fazy ( ↑ w zawale mięśnia sercowego, po zabiegach chirurgicznych)

6. Prozakrzepowe działanie Lp (a) - rysunek

7. Aterogenne działanie Lp (a)

8. Metody oznaczania Lp(a)

- metody immunoturbidymetryczne

- metody immunoenzymatyczne

9. Metoda immunoturbidymetryczna:

Antygen + Przeciwciało = kompleksy (zmętnienie)

(lipoproteina a) przeciwko Lp (a) (mierzymy absorbancję)

10. Metoda immunoenzymatyczna:

Inkubacja surowicy z przeciwciałami monoklinalnymi

↓

Usuwanie kompleksów Lp(a)- anty Lp(a)

↓

Inkubacja niezwiązanych przeciwciał anty Lp(a) z antygenem w fazie stałej

↓

Reakcja kompleksu Lp(a) - anty Lp(a) z koniugatem anty IgG (POD)

↓

Usuwanie niezwiązanego koniugatu

↓

Reakcja enzymatyczna

(natężenie barwy jest odwrotnie proporcjonalna do stężenia Lp(a) w próbce surowicy)

Hiperhomocysteinemia

11. Przyczyny:

• Uwarunkowane genetycznie niedobory (lub brak) enzymów, biorących udział w metabolizmie metioniny

• Nabyte niedobory kwasu foliowego i witaminy B6 i B12 (koenzymy przemian homocysteiny) - najczęstsza przyczyna!

• Hiperhomocysteinemia wtórna (w przebiegu innych chorób, np. niewydolności nerek, chorobach nowotworowych)

• Jatrogenne (wywołane lekami) oraz związane ze stosowaniem używek

12. Nasilenie hiperhomocysteinemii:

Poziom prawidłowy	<16 μmol/l
Postać łagodna	16-30 μmol/l
Postać umiarkowana	30-100 μmol/l
Postać ciężka	>100 μmol/l

13. Mechanizm patogennego działania homocysteiny na układ krążenia

Hiperhomocysteinemia:

• Działanie aterogenne

• Działanie trombogenne

14.

15. Działanie trombogenne:

• ↑ aktywności czynników krzepnięcia ( V, VII, TF)

• ↓ aktywności inhibitorów krzepnięcia (APC- aktywne białko C, ATIII , TM- trombomodulina)

Oznaczanie homocysteiny

16. Oznaczanie:

Pobranie krwi na oznaczanie homocysteiny

1.) krew pobrać rano, na czczo:

- na skrzep

Lub

- na antykoagulant: EDTA (najlepiej trójpotasowy), heparynę litową

2.) próbki odwirować najpóźniej w ciągu 1 godziny

3.) zaleca się trzymanie próbek w lodzie do czasu wirowania

4.) Przechowywanie próbek

2-8 stopni C 3dni

-20 stopni C 6miesięcy

17. Metody oznaczania homocysteiny:

Etap wstępny:

Redukcja różnych postaci homocysteiny związkowi o silnych właściwościach redukcyjnych (np. 2-merkaptoetanol, ditiotreitol DDT)

1. Chromatografia cieczowa o wysokiej rozdzielczości (HPLC)

• Oznaczanie ilościowe homocysteiny przez zastosowanie detektora elektrochemicznego lub fluorescencyjnego z równoległym oznaczeniem wzorców homocysteiny

Metody immunochemiczne

• Zastosowanie przeciwciał monoklinalnych przeciw s-adenozylohomocysteinie (powstaje w reakcji homocysteiny i adenozyny)

18. Zasada oznaczania homocysteiny na analizatorze IMX:

1. redukcja homocysteiny

HCY-S-S-Białko

------------------------------------- HCY (monocysteina)

HCY-S-S-HCY

HCY-S-S-Cysteina

2. enzymatyczna konwersja (pod wpływem hydrolazy SAH)

HCY + adenozyna → s- adenozylohomocysteina (SAH)

3. reakcja immunochemiczna (pod wpływem hydrolazy SAH)

anty-SAH → ilościowe oznaczanie HCY

*SAH

*fluorescenowany znacznik

CRP w ocenie ryzyka miażdżycy

19. Podwyższone stężenie CRP jest niezależnym czynnikiem ryzyka:

- zawału serca

- udaru mózgu

- miażdżycy kończyn dolnych

- zgonów sercowo- naczyniowych

U pacjentów, u których nie zaobserwowano klinicznych objawów chorób układu krążenia.

20. Zależność pomiędzy stężeniem CRP w surowicy a ryzykiem miażdżycy

Stopień ryzyka	Stężenie CRP
Niskie	<1 mg/l
Średnie	1-3 mg/l
Wysokie	>3 mg/l

21. Oznaczanie CRP za pomocą testów o wysokiej czułości (hsCRP)

1. czułość testów < 1mg/l ok. 0,3-0,7 mg/l

2. metody:

- immunoturbidymetryczne

- immunoefelometryczne ze wzmocnieniem lateksowym

3. materiał badany:

- surowica (natychmiast oddzielona od skrzepu)

- osocze (krew pobrana na heparynę, EDTA, fluorki lub cytrynian)

22. Zasada metod immunoturbidymetrycznych i immunonefelometrycznych ze wzmocnieniem lateksowym:

• Aglutynacja CRP z cząstkami lateksu opłaszczonymi przeciwciałami monoklonalnymi

• Pomiar zmętnienia wywołanego wytrącającymi się kompleksami immunologicznymi

• Wartość zmierzonej absorbancji pochodzącej od tego zmętnienia jest proporcjonalne do stężenia CRP w badanej próbce

23. Zasady wykonania oznaczeń CRP testami o wysokiej czułości

• Oznaczenia powinny być wykonywane dwukrotnie w odstępie 2tyg.

• Wyniki oznaczeń powinny być uśrednione i wyrażone w mg/l

• Materiał do badań należy pobierać w okresie pełnej stabilności metabolicznej (konieczne wykluczenie infekcji)

• Jeżeli oznaczony poziom CRP przekracza wartość 10 mg/l , badanie powinno być powtórzone

- przed ponownym wykonaniem oznaczenia CRP pacjenta należy dokładnie zbadać w celu wykrycia ewentualnych infekcji lub zapalenia

4

---