Chemia kliniczna -- wykład X 20.12.2010

1. Elektroforeza lipoprotein

2. Podłoża do rozdziału frakcji lipoproteinowych

• bibuła

• żel agarozowy

• żel agarozowo-agarowy

• octan celulozy

• żel poliakrylamidowy

rozmieszczenie frakcji lipoproteinowych od katody do anody

CHM

VLDL pre-β

LDL β

HDL α

3. Elektoforeza lipoprotein

rozdział

elektroforetyczny

densytogram

rozdziału

4. Metody wytrąceniowe oznaczania lipoprotein

5. Metody ilościowego oznaczania cholesterolu frakcji HDL

1. Wytrącanie lipoprotein LDL i VLDL

• Substancje wytrącające :

- polisacharydy sulfonowane (heparyna, siarczan dekstranu)

- fosforowolframian sodu

- glikol polietylenowy

• Obecność dwuwartościowych kationów: Mg⁺⁺, Mn⁺⁺, Ca⁺⁺

• obojętne pH

• temp. pokojowa

2. Odwirowanie probówki i oddzielenie supernatantu

3. Oznaczanie stężenie cholesterolu

6. Metody ilościowego oznaczania cholesterolu frakcji LDL

1. Wybiórcze wytrącanie lipoprotein LDL przy użyciu poliwinylosiarczanu.

2. Odwirowanie próbki i oddzielenie supernatantu.

3. Oznaczanie stężenia cholesterolu w supernatancie (cholesterol VLDL + cholesterol HDL)

4. Obliczenie stężenia cholesterolu LDL

chol. LDL = cholesterol całk. - cholesterol ( VLDL + HDL)

Metody bezpośrednie oznaczania cholesterolu HDL oraz cholesterolu LDL

8. Metody ilościowego oznaczania stężenia cholesterolu HDL

1. Wiązanie lipoprotein VLDL i LDL przez przeciwciała przeciwko lipoproteinom zawierającym apoB, co blokuje reakcję tych lipoprotein z odczynnikiem do oznaczania cholesterolu

2. Enzymatyczny pomiar cholesterolu HDL

9. Metody ilościowego oznaczania stężenia cholesterolu LDL

1. Eliminacja frakcji VLDL i HDL przy użyciu kompleksu polimerów i polianionów.

2. Wiązanie frakcji LDL z detergentem

3. Enzymatyczny pomiar stężenia cholesterolu LDL

10. Wzór Friedewalda

chol. LDL= chol. całk - chol. HDL - (triglicerydy / 5) [mg/dl]

chol. LDL = chol. całk - chol. HDL - ( triglicerydy / 2,2 ) [mmol/l]

formuła ma zastosowanie gdy stężenie triglicerydów < 400 mg/dl

< 4,5 mmol/l

11. Test zimnej flotacji

Jeśli po odwirowaniu krwi surowica jest lipemiczna to znaczy,że jest dużo triglicerydów.

(tylko trójglicerydy powodują zmętnienie surowicy)

Surowica po kilkunastu godzinach w lodówce :

- dalej jest jednolicie lipemiczna - znaczy to,że jest dużo VDL

- jest kożuszek na górze,a na dole jest przejrzysta - oznacza to dużą ilość chylomikronów

- jest kożuszek,a na dole jest mętna - są VDL i chylomikrony

12. Metody oznaczania apoprotein

1. Metoda radioimmunologiczna (RIA)

2. Metoda immunoenzymatyczna (ELISA)

3. Immunodyfuzja radialna (RID)

4. Immunoelektroforeza

5. Immunoturbidymetria

6. Immunonefelometria

13.

Nefelometria i turbidymetria metody do ilościowego pomiaru substancji nierozpuszczalnych, wywołujących zmętnienie

Nefelometria pomiar ilości światła rozproszonego w kierunku prostopadłym do kierunku padania światła

Turbidymetria pomiar światła przepuszczonego przez mętny roztwór

W metodach immunonefelometrycznych i immunoturbidymetrycznych zmętnienie wywołane jest reakcją precypitacji białek z odpowiadającymi im przeciwciałami.

14. Stężenie apolipoprotein

	Apo A1	Apo B
Wartości referencyjne	1,2 - 1,6 g/l (120 - 160 mg/dl)	0,6 - 1,6 g/l (60 - 160 mg/dl)
Wartości wysokiego ryzyka	< 1,2 g/l	> 1,6 g/l

15. Fenotyp apoE

apoE 2/2

apoE 2/3

apoE 3/3 (ta najczęściej)

apoE 3/4

apoE 4/4 u osób z tą izoformą gromadzą się LDL, występuje hiperlipoproteinemia typu II

apoE 2/4

16. Fenotypowanie wariantów genetycznych apoE metodą izoelektroogniskowania i immunoblotingu

1. Rozdział białek metodą izoelektroogniskowania

2. Przeniesienie białek rozdzielonych w procesie elektroforezy na filtr nitrocelulozowy

Trwałe wiązanie białek z podłożem

3. Inkubacja z pierwszym przeciwciałem (anty apoE)

Płukanie

Inkubacja z drugim przeciwciałem sprzężonym z peroksydazą

(anty IgPOD)

Płukanie

Wizualizacja metodą barwienia histochemicznego

(inkubacja z substratem dla peroksydazy)

17. Wartości pożądane parametrów lipidowych

• Cholesterol całkowity < 200 mg/dl (5,2 mmol/l)

• Cholesterol LDL < 130 mg/dl (3,4 mmol/l)

• LDL-c w cukrzycy <100 mg/dl (2,6 mmol/l)

i chorobach serca

mg/dl : 38,7 = mmol/l

• cholesterol HDL

mężczyźni ≥ 40 mg/dl (1,0 mmol/l)

kobiety ≥ 50 mg/dl ( 1,3 mmol/l)

• cholesterol HDL w cukrzycy

mężczyźni ≥ 45 mg/dl (1,2 mmol/l)

kobiety ≥ 55 mg/dl (1,4 mmol/l)

---