I. Biologiczne metody badania produktów leczniczych

Drobnoustroje występują wszędzie również w produktach kosmetycznych, lekach oraz w surowcach do ich wytwarzania. Produkty te nie powinny zawierać bakterii i grzybów chorobotwórczych. Natomiast stopień zanieczyszczenia innymi drobnoustrojami nie może przekraczać ustalonych wielkości, które regulowane są przez normy mikrobiologiczne produkcji w wymienionych działach przemysłu. Kontroli mikrobiologicznej powinny być poddane surowce oraz produkty końcowe, jak również poszczególne etapy wytwarzania. W uzasadnionych przypadkach dokonuje się identyfikacji wyizolowanych drobnoustrojów.

BADANIE JAŁOWOŚCI

Badanie jałowości ma na celu stwierdzenie, czy badany produkt jest wolny od żywych mikroorganizmów. Przy badaniu jałowości powinny być zachowane następujące warunki:

- używane materiały powinny być jałowe

- badania powinny być wykonywane w warunkach zapewniających aseptykę

- należy zapewnić optymalne warunki rozwoju dla szerokiego spektrum drobnoustrojów tlenowych i beztlenowych przy zastosowaniu odpowiednich podłóż, czasu i temperatury inkubacji

- należy inaktywować albo usunąć wszelkie czynniki bakteriostatyczne i grzybostatyczne, które mogą być obecne w preparatach i mogą hamować wzrost drobnoustrojów

Badanie można wykonać dwiema metodami. Wybór metody zależy od tego, czy analizowane produkty wykazują właściwości hamowania wzrostu drobnoustrojów.

1. Metoda z użyciem sączków membranowych - stosuje się do produktów hamujących wzrost drobnoustrojów.

2. Metoda posiewu bezpośredniego - wykorzystuje się w przypadku, gdy preparat nie wykazuje działania hamującego wzrostu, jak również gdy możliwa jest inaktywacja substancji hamujących.

Przed przystąpieniem do badań przeprowadza się próby testowe ze szczepami wskaźnikowymi w celu ustalenia żyzności i jałowości podłoży. Drobnoustroje testowe to bakterie tlenowe i beztlenowe oraz grzyby.

Jeśli po inkubacji nie stwierdza się wzrostu drobnoustrojów, produkt ocenia się jako jałowy.

BADANIE CZYSTOŚCI MIKROBIOLOGICZNEJ

Badanie czystości mikrobiologicznej ma na celu oznaczenie w preparatach gotowych (dla których nie jest wymagana jałowość), liczby żywych drobnoustrojów tlenowych (bakterie, grzyby) oraz określenie obecności drobnoustrojów chorobotwórczych i oportunistycznych: Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa, Clostridium spp., drobnoustrojów z rodziny Enterobacteriaceae i innych pałeczek Gram-ujemnych.

Badanie, podobnie jak przy badaniu sterylności, wykonuje się dwiema metodami. Badanie należy wykonać używając podłoży namnażających, a następnie wybiórczych.

Wymagania jałowości i czystości mikrobiologicznej dla różnych grup leków podaje Farmakopea Polska wyd. VI (2002) Tabela 32 str. 119 oraz Farmakopea Europejska

Farmakopea Polska oraz Farmakopea Europejska

jest zbiorem podstawowych wymagań odnoszących się do składu i jakości środków farmaceutycznych oraz metod badania surowców farmaceutycznych i leków.

Liczne gałęzie przemysłu poświęcają wiele czasu i środków na mikrobiologiczną kontrolę jakości produktów (np. przemysł spożywczy).

Sposoby identyfikacji bakterii:

1. metody tradycyjne

2. metody nowoczesne oparte o analizę DNA

Add. 1. Materiałem wyjściowym do badań musi być czysta kultura.

W pierwszej kolejności wykonywane są podstawowe obserwacje: barwienie Grama, obserwacje mikroskopowe (określanie morfologii komórek), ocena ruchliwości, wytwarzania endospor, zdolności do wzrostu w warunkach tlenowych i beztlenowych, testy biochemiczne np. testy API

Inne testy:

Typowanie

To porównanie nieznanego szczepu ze szczepem znanym danego gatunku (rodzaj identyfikacji),

to rozróżnianie poszczególnych szczepów danego gatunku (rodzaj klasyfikacji).

- testy serologiczne (testy aglutynacji - badanie różnic w antygenach powierzchniowych)

- typowanie bakteriofagami (badanie wrażliwości na bakteriofagi, np. Staphylococcus ureus, Yersinia enterocolitica)

- elektroforetyczna analiza enzymów (porównanie ruchliwości elektroforetycznej różnych enzymów bakterii)

Add. 2. Nowoczesne metody wykrywania i identyfikacji:

- techniki hybrydyzacji DNA:DNA z wykorzystaniem specyficznych sond molekularnych

- wykorzystywanie technik PCR

- analiza wzorów restrykcyjnych DNA - metoda RFLP (polimorfizm długości fragmentów restrykcyjnych)

Wymagania mikrobiologiczne - normy dla kosmetyków

- Wymagania ilościowe (minimalna wielkość badanej próbki - 1 g lub 1 ml)

KATEGORIA I. Kosmetyki przeznaczone dla dzieci i w okolice oczu

Ogólna liczba drobnoustrojów tlenowych mezofilnych nie może przekraczać 100 jtk/g lub ml

(jtk - jednostki tworzące kolonie)

KATEGORIA II. Inne kosmetyki

Ogólna liczna drobnoustrojów tlenowych mezofilnych nie może przekraczać 1000 jtk/g lub ml

Bardzo ważna jest interpretacja wyników. Opisane ograniczenia powinny być interpretowane następująco:

10² - maksymalny limit akceptacji to 5 x 10²

- Wymagania jakościowe

W 0,1 g lub 0,1 ml próbki kosmetyku nie mogą być obecne następujące drobnoustroje:

- Pseudomonas aeruginosa,

- Staphylococcus aureus,

- Candida albicans.

Normy dla żywności - wybrane produkty

normy mikrobiologiczne	mikroorganizmy	limit	metoda referencyjna	Etap analizy
Mięso mielone	Liczba bakterii tlenowych	5x 10^6 jtk/g	ISO 4833	w gotowym produkcie
		E. coli	5x 10^2 jtk/g	ISO 16649-1 oraz 2	w gotowym produkcie
Mleko pasteryzowane	Enterobacteriaceae	5 jtk/ml	ISO 21528-1	w gotowym produkcie

jtk - jednostka tworząca kolonię

---