BAKTERIE LAB:

-mają status GRAS bakterie bezpieczne i niechorobotwórcze dla ludzi

-należą do nich Lactococcus, Lactobasillus, Streptococcus i Bifidobacterium spp.

-wiele z nich stosowanych jako PROBIOTYKI, wywierają korzystny wpływ na zdrowie człowieka

Probiotyki:Żywe drobnoustroje stanowiące uzupełnienie diety człowieka, które podawane w odpowiednich ilościach wywierają korzystny wpływ na organizm. Odkryte przez Miecznikowa

Cechy probiotyków:

1.pochodzą z naturalnej mikroflory

2.oporne na działanie enzymów trawiennych i żółci

3.zdolne do kolonizacji przewodu pokarmowego i trwałego przyjegania do nabłonka jelita

4.wytwarzają substancje hamujące wzrost innych drobnoustrojów

5.wykazują antagonizm wobec patogenó

STOSUJE SIĘ JAKO NOŚNIK AKTYWNYCH BIOLOGICZNIE CZĄSTECZEK np.ANTYGENÓW W celach PROFILAKTYCZNYCH I TERAPEUTYCZNYCH

6.poprawiają smak produktów

BAKTERIE LAB DZIĘKI TEMU, ŻE WYWIERAJĄ KORZYSTNY WPŁYW NA ORGANIZM I MAJĄ NISKĄ IMMUNOGENNOŚĆ

(mogą być wielokrotnie stosowane)

Lactobacillus składniki naturalnej mikroflory

Streptococcus

Lacococcus lactis nie kolonizuje przewodu pokarmowego

Bakterie mlekowe:

• Homofermentatywne

• Heterofermentatywne

• Pałeczki, laseczki

• Nieruchliwe, nieprzetrwalnikujące

• W jamie ustnej wywołują prochnicę

• Na plazmidzie cechy oporności na bakteriofagi, antybiotyki, wytwarzanie bakteriocyn

ĆWICZENIE:Przed zastosowaniem bakterii mlekowych w szczepionkach należy określić ich właściwości:

1.wykorzystanie laktozy

2.produkacja kwasu mlekowego

3.własności proteolityczne

4.produkcja bakteriocyn

2.produkcja kwasu mlekowego

Pożywka:

-M17 agar

-laktoza

-purpura bromokrezolowa

Posiew:Dowolny

Obserwacja: Zażółcenie wokół kolonii

Wnioski: Pod wpływem zakwaszenia środowiska przez kwas mlekowy purpura bromokrezolowa zmienia zabarwienie na żółty

3.własności proteolityczne

Pożywka:

-mleko odtłuszczone

-agar

-glukoza

Posiew: Kreską

Obserwacja: Przejaśnienia

Wnioski: Szczep ma właściwości proteolityczne

4.produkcja bakteriocyn

Pożywka:

-glukoza

-agar

Posiew: dolna warstwa szczep podkładkowy, w postaci murawy, nakraplamy szczep badany(wytwarzający bakteriocyny)

Obserwacja: Przejaśnienia

Wnioski: obecność bakteriocyn

Nizyna jest najepiej poznaną bakteriocyną. Produkowana przez Lactococcus lactis zyskała status GRAS (generally recognised as safe). Posiada bardzo niską toksyczność, dawka letalna to 7 mg/kg. Oczyszczona nizyna jest odporna na ogrzewanie w 100⁰C przez 10 min. w pH 2,0. Stosowana jako środek konserwujący w 46 krajach w produktach mlecznych i puszkowanej żywności. Jej aktywność obejmuje szeroki zakres szczepów takich jak: Lactococcus, Streptococcus, Staphylococcus, Micrococcus, Pediococcus, Lactobacillus, Listeria i Mycobacterium jak również spory i formy wegetatywne Bacillus i Clostridium. Działanie lantybiotyków nie ogranicza się tylko do bakterii gramdodatnich, zaobserwowano również aktywność przeciwko bakteriom gramujemnym E.coli i Salmonella. Nizyna używana jest jako biokonserwant od około trzydziestu lat, ale mechanizm jej działania wyjaśniony został dopiero w ostatnich latach.. Wrażliwe organizmy wykazały zaburzenia w syntezie DNA, RNA, białek i polisacharydów

WYKORZYSTANIE BIAŁEK BAKTRYJNYCH PATOGENÓW W MEDYCYNIE

Czynniki rozprzestrzeniania:

• zewnątrzkomórkowe enzymy hydrolityczne ułatwiające patogenom rozprzestrzenianie się w organizmie gospodarza i dotarcie do właściwej niszy ekologicznej

• np. proteazy, nukleazy, kolagenazy...

• dużą ich liczbę wytwarzają Staphylococcus i Streptococcus

Streptokoki produkują:

1. streptodornazanukleaza, rozpuszcza wszelkie substancje w ropniach

2. streptokinaza aktywuje plazminogen, przez zmianę jego konformacji, dając plazminę- proteazę serynową, która rozkłada fibrynę w skrzepie i kazeinę w doświadczeniu

substancje pochodzenia bakteryjnego stosowane w medycynie:

1. substancje do terapii terapia przeciwzakrzepowa

• streptokinaza

• streptodornaza

(alteptazarekombinowany tkankowy aktywator plazminogenu)

(preparaty pochodzenia ludzkiego (pochodne aktywatorów plazminogenu tPa i uPa, które są proteazami serynowymi, aktywują na)

• białko Pla z Yersinia pestis, które aktywuje plazminogen na drodze hydrolizy

(proby SOMATYCZNEJ TERAPII GENWEJumieszczenie w kom.endothelium genu warunkującego wytwarzanie aktywatora plazminogenu)

strategie aktywacji plazminogenu przez mikroorg.:

-wytwarzanie zewnątrzkom. aktywatora plazminogenu

-przez receptory dla plazminogenu na powierzchni błony lub organelli lub pl zdolne do wyłapywania i wiązania plazminogenu, co doprowadza do jego aktywacji

2. toksyna botulinowa:

w medycynie:

-leczenie zeza

-leczenie przykurczy mięśni - porażenie mózgowe

w kosmetyce:

-wygładzanie zmarszczek BOTOX

• produkowana przez Clostridium botulinum

• egzotoksyna, neurotoksyna

• mieszanina kilku białek (typy A-G), najbardziej toksyczne A,B,E, a C i D toksyczne dla zwierząt

• wrażliwa na wysoką temperaturę i na wysokie zasolenie

• blokuje wydzielanie acetylocholiny w synapsach, powoduje rozluźnienie mięśni

3. dekstran:

- środek zastępczy krwi płyn, który przetacza się do krwi, aby przywrócić objętość krwi, aby małe naczynia włosowate się nie zapadły

• polimer o wysokim ciężarze cząsteczkowym, składnik śluzu Leuconostoc mesentedoides

4.wykorzystanie rekombinowanych białek: insulina,szczepionki podjednostkowe

Łatwa procedura i niskie koszty powodują, że systemy bakteryjne i drożdżowe to najczęściej stosowane systemy ekspresyjne.

Po transformacji odpowiednich szczepów i hodowli w małej objętości, identyfikujemy klony wykazujące znaczny poziom ekspresji produkowanego białka. Na tej podstawie wybieramy odpowiedni system ekspresyjny. Ostatnim etapem jest oczyszczanie białka z wykorzystaniem metod chromatograficznych. Czystość uzyskanych preparatów jest potwierdzana przez analizy SDS-PAGE i HPLC.

5.Immunotoksyny: - lecznie niektó®ych form nowotworów

Immunotoksynami nazywamy połączenia przeciwciał monoklonalnych z toksynami. Zasada działania takich koniugatów polega na tym, że po przyłączeniu się do danego antygenu (np. na powierzchni komórki nowotworowej) toksyna może niszczyć komórkę niosącą ten antygen. W ten sposób mogą być niszczone określone komórki bez szkody dla innych komórek organizmu.

Przciwciałorozpoznaje kom. docelową

Toksynazabija

ĆWICZENIE:Cel:Wykazanie aktywności sklonowanego w kom. E coli genu streptokinazy

1.Przygotowanie konstuktów

• gen sck sklonowany i zsekwencjonowany

• stanowi niezależną jednostkę transkrypcyjną

• na końcu aminowym znajduje się peptyd synałowy, odcinany w czasie wydzielania przez komórkę, rejon środkowy genu jest niezbędny do aktywności białka

1. Utworzenie banku genowmowego DNA z wykorzystaniem wysokokopijnych plazmidów pTZ19R

2. Znalezienie klonów kazeinolitycznych

3. Przeklonowanie genu skc do pBR322 otrzymując dużo bardziej stabilny plazmid rekombinacyjny pSB1

w tym plazmidzie

gen skc wyrażany z własnego promotora

P RBS ATG s.s. skc T

Białko peryplazmatyczne, kolonie mukoidalne

Skc+

4. Fragment DNA pSB1 sklonowano w pUC18 gdzie jest LacZ

FUZJA TRANSKRYPCYJNA

w tym plazmidzie p8

P.laktozowy RBS ATG s.s. skc T

ekspresja genu skc pod kontrolą promotora lac

Białko peryplazmatyczne, kolonie mukoidalne

Skc+

5. Skonstruowanie FUZJI TRANSLACYJNEJ genu lacZ i skc, powstaje plazmid rekombinacyjny pKH2

w tym plazmidzie

P RBS ATG lacZ skc T

Białko cytoplazmatycznebrak sekw.sygnałowej, fuzja z beta-galaktozydazą-> oba geny w jednej ramce odczytu, kolonie niemukoidalne

CWICZENIE:Test szalkowy wykazujący aktywność streptokinaz:

streptokinaza-plazminogendegradacja kazeinystrefy przejaśnienia wokół koloni wytwarzających streptokinazę, obserwacja mukoidalności koloniiwynik peryplazmatycznej lokalizacji streptokinazy

Przygotowanie szalek:

1.wylać szalki LB z antybiotykiem

2.Przygotować wierzchnią warstwę (agaroza +bufor, NaCl, jałowe mleko, plazminogen)

TRANSFORMACJA SZCZEPÓW E.coli DNA PLAZMIDOWYM KODUJĄCYM STREPTOKINAZĘ:

1.Do odpowiednich kom.kompetentnych dodać preparat DNA

2.Inkubować w lodzie 15minut. Zawieszone w glicerolu

3.Zawiesinę bakterii przenieść do temp. 42-44 na 40 sekund

4.Dodać do 1 ml podłoża LB i inkubować 40 minut w 37 stopniach

5.Wysiać odpowiednio rozcieńczoną mieszaninę transformującą na podłoże selekcyjne

pSB1/E.coli

warstwa dolna LB+Tc//warstwa górna LB + mleko+plazminogen

Obserwacje: kolonie śluzowate- białko peryplazmatyczne, są przejaśnienia dookoła kolonii, nie dookoła wszystkich kolonii są przejaśnienia to jest efekt małej wydajności promotora

p8/E.coli

warstwa dolna LB+Amp//warstwa górna LB +mleko+plazminogen

Obserwacje: kolonie śluzowate, są przejaśnienia, podrost wynika ze skorzystania z beta-laktamazy innych bakterii

pKH2/E.coli

warstwa dolna LB +Amp//warstwa górna LB+mleko+plazminogen

Obserwacje:obecność przejaśnien, brak śluzowatego wyglądu

Podrost największe kolonie - właściwe transformanty

-malutkie kolonie nie są oporne, wykorzystują cudze enzymy

kontrola - Bluescript mleko + plazminogen

SZCZEPIONKI NOWEJ GENERACJI:

Z ćwiczeń 3 Szczepionki:

atenuowane np. przez delecję genó odpowiedzialnych za wirulencję

zabite mikroorganizmy

białka

Zalety atenuacji (musimy mieć pewność, że atenuacja jest nieodwracalna):

Indukcja intensywniejszej odpowiedzi imm., zabite org, indukuję bardzo słabą

Stosowanie atenuowanych organizmów do przeniesienia antygenów innych patogenów

odwrotna wakcynologia

mamy sekwencję genomu-> analiza in silico program wykrywa geny kodujące białka powierzchniowe

WYKORZYSTANIE BAKTERII MLEKOWYCH JAKO NOŚNIKA ANTYGENU:

-atenuowanae bakterie mlekowe

-antygen wklonowany do DNA bakterii mlekowych

-antygen powinien ulegać ekspresji promotory konstytutywne lub indukowalne

-antygen powinien być wydzielany na zewnąrz komórkipowinien mieć sekwencję syngałową

-antygen może być albo na plazmidzie (w wielu kopiach-plazmidy wielokopijne)

-antygen może być na chromosomie (+silny promotor)

rozważa się użycie bakterii LAB jako nośników antygenów

Izolacja genów kodujących determinanty patogenezy

Listeria monocytogenes:

• Organizm modelowy w badaniach nad odp.imm.generowaną wewnątrzkom.

• Izolacja i charakterystyka mutantów insercyjnychokreślenie funkcji i lokalizacji genów kodujących determinanty patogenezy

• Determinanty patogenezy Listeria:

-listeriolizyna O (LLO, gen hly, egzotoksyna, główny czynnik wirulencji, z rodziny hemolizyn)

-fosfolipaza

• Listeria wnika drogą pokarmową (odporna jest na działanie HCl i enzymów trawiennych)

• Przylega do komórki (adhezyny, internaliny)

• Przenika do kępek Peyera, ma internalinę, która wywołuje fagocytozę

• Zdolność przenikania bakterii przez błony wakuoli jest uwarunkowana aktywnością hemolityczną wydzielenie LLO, białko Act A odpowiedzialne jest za ruch , fosfolipaza odpowiedzialna jest za hydrolizę lipidów

Hemolizyny hly

Fosfolipazy plc

MHC II MHC I

Listeria pobudza I i II układ zgodności tkankowej

Wykorzystanie w szczepionkach antygenów zewnętrznych (MHC I)(nukleoproteina wirusa grypy NP), antygeny powierzchniowe- najbardziej zmienne=> szczepionki stają się nieskuteczne

Wykorzystanie białek wewnętrznych => są lepsze, bo stabilniejsze!!!

Sposoby atenuacji:

osłabienie szczepu=> mutageneza=> pasażowanie

Szczepionka nowej generacji (chromosom Listeria + obce antygeny np. nukleoproteiny wirusa grypy...antygeny nowotworowe=> szczepionki przeciwnowotworowe)

Przewaga szczepionek nowej generacji nad starymi!!! Pytanie?

Użycie bakterii patogennej

niepatogennej z czynnikami patogenezy

WYSPY PATOGENNOŚCI- Kodują zespół czynników wirulencji, na chromosomie lub plazmidzie

PCR:

-łańcuchowa reakcja polimerazy

-metoda powielania DNA in vitro, polegająca na sekwencji wielokrotnego podgrzewania i oziębiania próbki.

Powielony frag. Nie musi być oddzielony od reszty genomu, po amplifikacji odzielamy fragment dzięki ELEKTROFOREZIE w żelu agarozowym

Wykorzystanie B. Subtilis jako nośnika antygenów:

zawiera wklonowany do kasety SPAC gen kodujące hemolizynę L.monocytogenesnabycie cech patogenazdolność do wnikania do komórki

doklonowanie do kasety genu kodującego białko przeciw któremu chcemy wywołać odpowiedź immunologiczną

ĆWICZENIE:

1.Izolacja DNA B.subtilis

Zwirować nocną hodowlęzlać supernatantosad zawiesić w SSC (NaCl+cytrynian sodu)zwirowaćzlać supernatantosad zawiesić w buforze lizującym (bufor fosforanowy+sacharoza+lizozym)inkubowaćdodać roztworu lizującego ściany mureinowe (Tris+EDTA+SDS)inkubować w 37inkubować w 75stopniachpróbkę zworteksować i wirowaćpobrać supernatantdodać do supernatantu bufor ORANGE-DX i wymieszaćmieszaninę przenieść do minikolumnywirowaćwyrzucić przesączumieścić minikolumnę w probówce odbierającejdodać buforu płuczącego Wash-DX->wirowaćznowu wylaćwirować w celu usunięcia resztek buforu płuczącegominikolumnę umieścić w sterylnym eppendorfiedodać buforu Elution-DXpozostawic ją na 2 min w temp. Pokojowej zwirować i mamy!

Składniki PCR:

-matryciwy DNA nasz preparat

-dNTP roztwór trinukleotydów

-sekw. Flankujące interesujące nas geny prawy i lewy primer

-termostabilną polimerazę

-woda dejonizowana

-bufor

Analiza produktów PCR:

Do probki dodać barwniknanieść do dołkównałożyć wzorzecrozdzielać w żelu agarozowymżel zabarwić bromkiem etydyny

KREW+TOKSYNY BAKTERYJNELIZA

Określenie aktywności hemolitycznej supernatantu pohodowlanego:

Przygotowanie krwi baranka:

Odpłukanie osocza od erytrocytów

-krew zawiesić w PBS(sól fizjologiczna buforowana)zwirowaćodrzucić supernatantkrwinki zawiesić w PBSpłukać 3 razy

Przygotowanie próbek do testu

PBS+zawiesina erytrocytów preinkubować

Do probówek z erytrocytami i PBS dodać:

Supernatant znad badanych szczepów SDS woda

PROBA BADANA KONTROLA + KONTROLA -

Inkubować zwirować probki supernatant rozcieńczyć 10xZmierzyć absorbancję (ślepa próba=kontrola -)

Obliczenie aktywności w jednostkach hemolitycznych:

Absorbancja kontroli - = 0 jednostek

Absorbancja kontroli+ (SDS)=100 jednostek hemolitycznych

Np.

1.347 - 100 j.h.

0 - 0 j.h.

0.01347 - 1 j.h.

0.061 - x j.h. x=4.5 j.h

OPATRUNEK FAGOWY

Fagi:

• Wewnątrzkomórkowe pasożyty bakterii zdolne do reprodukcji w innych komórkach

• Pozbawione własnego metabolizmu (nie syntezują zw.drobnocząsteczkowych i nie mogą syntezować ani pobierać energii)

• Odkrywcy fagów: Frederick Twort i Felix D'Herelle (wprowadził pojęcie bakteriofag i terapia fagowa)

• Maisin wyleczył w 1921 zakażoną gronkowcami skórę

• D'Herelle zastosował fagi do walki z czerwonką, cholerą, dżumą, tyfusem, infekcjami skórnymi

Po odkryciu antybiotyków zostały:

1.Gruzja Tibilisi - sterylizacja pomieszczen, walka z zakażeniami

2.Polska Ośrodek Terapii Doświadczalnej- Bruno Jasiński, Wrocław-opracowanie terapii przeciwko czeronce, biegunkom, zakażeniom krwi, zapaleniu opon mózgowych, owrzodzeniom, zakażeniom pooperacyjnym i pooparzeniowym

Wzrost szczepów antybiotykoopornych-powrót do terapii fagowych.

Projekty badawcze:

walka z paciorkowcami jelitowymi opornymi na wankomycynę, które zabijają chorych na nowotwory i AIDS

walka z Salmonella,Shigella i E.coli w produktach mięsnych i drobiowych

krople do oczu przeciwko zakażeniom gronkowcowym

walka z bakteriami MRSA (odporne na antybiotyki S.aureus)

wniosek o patent bandaża PhagoBioDerm

BAKTERIOFAGI:

2 postaci:

-faza wegetatywna (wewnątrzkomórkowa)- nie widać go

-faza spoczynkowa - obserowalny

Swoistość względem gospodarza:

Adsorpcja cząsteczek fagowych odbywa się z udziałem odpowiednich białek fagowych i receptorów komórkowych np. receptor faga lambda łączy się z białkiem LamB E.coli.

Brak receptora dla fagaoporność na bakteriofaga

Mechanizmy zmieniające swoistośc (warunkujące oporność bakterii)

1. Mutacje bakterii w wyniku których zmieniają się białka receptorowe

2. Mutacje faga warunkujące adhezhę do zmienionych receptoró

3. Restrykcje i modyfikacje

\mycobacterium smegmatis z fagiem może służyć jako wektor w leczeniu gruźlicy

Na 1 bakterie przypada 10 fagó

10^30- ilość bakterii na Ziemii

10^31- ilość fagó na Ziemii

Dobre źródło fagó:

Ścieki komunalne, wody, studzienki

RÓŻNICE MIĘDZY ANTYBIOTYKAMI A BAKTERIOFAGAMI

Antybiotyk musi być podawany ciągle, natomiast liczba fagó wzrasta, aż do momentu kiedy zaobserwujemy wyleczenie pacjenta

MOC fagowa preparatu: ILOŚĆ CZĄSTEK FAGOWYCH/ML

Opatrunek fagowy musi mieć dużą powierzchnię kontaktu ze skórą(płyny, galaretki), stosuje się szkielety organiczne np. substancje żelowe. Moc opatrunku bada się przez obserwacje stref zahamowania wzrostu.

WYKONANIE OPATRUNKU FAGOWEGO:

1.Znaleźć bakterie, wyizolować ją w stanie czystym

2.Dobrać bakteriofaga, oczyścić, namnożyć

3.Nanieść go na ranę

Ćwiczenie:

CEL:Przygotowanie opatrunku fagowego:

opatrunek fagowy w postaci immobilizowanej w ŻELU AGAROZOWYM zawiesiny fagowej

opatrunek w postaci immobilizowanej w ŻELU AGAROZOWYM zawiesiny fagowej umieszczonej na nośnikuGAZA

opatrunek w postaci nasączonego zawiesiną faga nośnika organicznego - GAZA

Kontrole:

• Kontrola negatywna KO zamiast zawiesiny faga RF

• Kontrola pozytywna(antybiotykowa) K1 RF+antybiotyk (np.1 mikrogram x ml^-1)

1.Krzywa lityczna:

-hodowle bakterii zaszczepić zawiesiną faga

-określić OD startowe

-hodowlę prowadzić przez dwie godziny, OD mierzyć co 30 minut

-określić miano faga i ilość bakterii w hodowli dwugodzinnej

-zwirować bakterieSUPERNATANT (źródło fagów)

2.Izolacja specyficznych fagów

• Próbkę gleby (źródło faga)dodajemy do hodowli bakteryjnej

• Inkubacja 37 prze dwa dni

• 1ml zbieramy, wirujemy, zbieramy supernatant

• dodajemy chloroform do supernatantu, worteksujemy

• wirujemy

• Określić miano faga w rozcieńczeniu -1 i -6 na szalkach duwarstwowych

• Inkubować w 37

• Zebrać cienką warstwę agaru z powstałych łysinek do eppendorfa

3.Zbadanie swoistości faga

1. na szalki z agarem odżywczym nanieść zawiesinę faga w postaci kreski

2. bakterie nanieść w postaci kresek poprzecznych

3. inkuboać w 37

4. obserwować strefy zahamowania wzrostu

4.Przygotowanie opatrunku fagowego:

• pobrać supernatant

a)zmieszać s. z agarem

b)zmieszać s. Z agarem-> nasączyć gazę

c)nasączyć gazę supernatantem

-przygotować kontrole

5.Zbadanie aktywności i trwałości opatrunku fagowego

przeprowadzić tego samego dnia i po upływie tygodnia

-przygotować szalki dwuwarstwowe

-podzielić je na 4

-połozyć opatrunki

-inkubować

-oznaczyć wielkość stref zahamowania wzrostu

SZALKI DWUWARSTWOWE:

Na dola cienka warstwa agaru stałego

Na górze agar + bakterie

Obliczenie miana faga:

Wylać cienką warstwę agaru

Przygotować serię rozcienczeń faga metodą próbókową

Do probówki pobrać agar +bakterie+fag i wylać to na agar

Inkubować

Obliczyć ilość łysinek i miano faga w roztworze wyjściowym

Oznaczenie ilości bakterii

Wylać warstwę agaru

Przygotować serie rozcieńczeń metodą probókową

Pobrać 0.1 próbki

Nakroplić i rozprowadzić głąszczką

Inkubować

Obliczyć ilość kolonii i miano bakterii w roztworze wyjściowym

Podniesienie indukowanej specyficzności odp.imm.

Stosowany do krótkotrwałego dostarczania antygenów

Limfocyt B

Limfocyt T cytotoksyczny

Bakteria

(obcy antygen)

---