Wykład 2

Metody spektroskopowe - część 1

Metody spektroskopowe

I. Spektroskopia molekularna - zajmuje się oddziaływaniem promieniowania elektromagnetycznego z cząsteczkami

II. Spektroskopia atomowa - polega na interpretacji widm atomowych i wykorzystuje ilościowe zależności pomiędzy przejściami elektronowymi, a oddziałującą na nie energią

Promieniowanie elektromagnetyczne

Fala - opisana wzorem:

=c/

- długość fali

c - prędkość rozchodzenia się światła w próżni

 - częstość

Fotony - ich energię określa zależność Plancka:

E = h = h c/

h- stała Plancka

Widmo elektromagnetyczne

długość fali

• fale radiowe >10⁸ nm

• mikrofale 10⁶ -10⁸ nm

• podczerwień IR 10³ -10⁶ nm

• VIS 10² - 10³ nm

• UV 10 - 10² nm

• RTG 10^-1- 10 nm

• γ <10^-1 nm

Spektroskopia molekularna

Całkowita energia cząsteczki - suma energii związanych z różnymi formami ruchu:

• energia translacji - jest wynikiem swobodnego ruchu cząsteczki w przestrzeni

• energia rotacji - związana z obrotem cząsteczki wokół osi przechodzącej przez jej środek masy

• energia oscylacji - związana z drganiami atomów wokół położenia równowagi

• energia elektronowa - obejmująca energię kinetyczną ruchu elektronów w cząsteczce i energię potencjalną związana z przyciąganiem elektronów przez jądro i odpychaniem przez sąsiednie elektrony

Energia translacji nie podlega ograniczeniom kwantowym i zmienia się w sposób ciągły

Energia rotacji, oscylacji i elektronowa są skwantowane!

E = E_el+E_osc+E_rot

Energie poziomów rotacyjnych, oscylacyjnych i elektronowych różnią się pomiędzy sobą:

E_el > E_osc> E_rot

Absorpcja promieniowania elektromagnetycznego przez cząsteczki powoduje wzbudzenie odpowiednich poziomów energii - efektem mierzalnym tego zjawiska jest widmo!

• promieniowanie z zakresu mikrofal i dalekiej podczerwieni = wzbudzenie rotacyjnych poziomów energii - efektem jest widmo rotacyjne (spektroskopia mikrofalowa)

• promieniowanie IR - wzbudzenie poziomów oscylacyjnych - powstaje widmo oscylacyjne (spektrofotometria w podczerwieni i spektroskopia Ramana)

• promieniowanie z zakresu uV/VIS i bliskiej podczerwieni - wzbudzenie elektronów - powstaje elektronowe widmo absorpcyjne (spektrofotometria uV/VIS)

Spektroskopia molekularna

1. Spektrofotometria UV-VIS

2. Spektrofluorymetria

3. Spektrofotometria w podczerwieni (IR)

4. Spektrometria ramanowska

5. Spektroskopia magnetycznego rezonansu jądrowego (NMR)

SPEKTROFOTOMETRIA UV-VIS

Reguły wyboru = prawdopodobieństwo przejść elektronowych pomiędzy poszczególnymi stanami energetycznymi cząsteczki, między innymi:

• aby nastąpiła absorpcja promieniowania, muszą istnieć takie stany kwantowe cząsteczki A i B, których różnica energii odpowiada energii (h) promieniowania padającego:

E_B-E_A= h

Przejścia dozwolone = spełniające reguły wyboru

Przejścia wzbronione = niespełniające reguł wyboru

Prawa absorpcji

I Prawo absorpcji (prawo Lamberta)

I=I₀ e^-kb

I₀ - natężenie wiązki promieniowania monochromatycznego padającego na jednorodny ośrodek absorbujący

I - natężenie wiązki promieniowania po przejściu przez ośrodek absorbujący

b - grubość warstwy absorbującej

k - współczynnik absorpcji

I₀

ln = kb = A

I

lub

I₀

A = log = ab

I

a = 0,4343k

b - grubość warstwy

A - absorbancja (zdolność pochłaniania promieniowania)

Absorbancja jest proporcjonalna do grubości warstwy absorbującej, jeśli wiązka promieniowania monochromatycznego przechodzi przez jednorodny ośrodek absorbujący.

II Prawo absorpcji (prawo Lamberta - Beera) - dotyczy absorpcji promieniowania przez roztwory

I = I₀ e^-kbc

I₀

A = log = abc c - stężenie roztworu

I

Jeżeli współczynnik absorbancji rozpuszczalnika jest równy zeru, to absorbancja wiązki promieniowania monochromatycznego przechodzącej przez jednorodny roztwór jest wprost proporcjonalna do stężenia roztworu c i grubości warstwy absorbującej b.

III Prawo absorpcji (prawo addytywności absorpcji)

Absorbancja roztworu wieloskładnikowego równa się sumie absorbancji poszczególnych składników:

A = A₁ + A₂ + ..... A_n

Transmitancja - T

I 1

T = A = log

I₀ T

%T = 100T

100

A = log

%T

A = a c b

a - właściwy współczynnik absorpcji (gdy stężenie wyrażamy w g/cm³)

A =  c b

 - molowy współczynnik absorpcji (gdy stężenie wyrażamy w mol/dm³)

[] = [dm³ mol^-1 cm^-1] = [m² mol^-1]

 - nie zależy od stężenia roztworu

• - jego wartość jest stała dla danego chromoforu

• - zależy od długości fali l promieniowania padającego

Miarą intensywności absorpcji promieniowania przez roztwór danej substancji jest wartość molowego współczynnika absorpcji _max przy długości fali odpowiadającej maksimum absorpcji _max charakterystycznej dla tej substancji.

Krzywa absorpcji = elektronowe widmo absorpcyjne

Odchylenia od praw absorpcji

1. Podstawowe ograniczenia praw:

• prawa absorpcji są spełnione dla roztworów rozcieńczonych (c<10^-2 mol/dm ³), w których e nie zależy od współczynnika załamania światła n

• zakłada się, że jedynym oddziaływaniem promieniowania elektromagnetycznego z substancją rozpuszczoną jest absorpcja promieniowania:

X + hn -> X*

X* -> X + ciepło

Możliwe jest przejście z emisją kwantu promieniowania (fluorescencją)

X* -> X + ciepło + h'

' - częstość promieniowania emitowanego w wyniku fluorescencji

2. Czynniki chemiczne - powodujące odchylenia od praw absorpcji związane z reakcjami chemicznymi zachodzącymi w analizowanym roztworze. Zmiana pH, czy zmiana stężenia roztworu mogą powodować takie reakcje jak:

• dysocjacja

• asocjacja

• polimeryzacja

• solwatacja

• reakcje kompleksowania

3. Czynniki aparaturowe

• brak monochromatyczności

• występowanie promieniowania rozproszonego = docierającego do detektora z pominięciem badanego roztworu

Spektrofotometry UV-VIS

źródło kuweta

promieniowania monochromator pomiarowa detektor

wskaźnik

rejestrator

komputer

Źródło światła - zakres 180 nm do 800 nm

• lampy deuterowe (180 - 380 nm)

• lampy wolframowo-halogenowe (380 - 800 nm)

• wysokociśnieniowe łukowe lampy ksenonowe (cały zakres UV-VIS)

Monochromator - wycina z promieniowania emitowanego przez źródło wąskie pasmo o żądanej długości fali:

1. źródło promieniowania

2. szczelina wejściowa

3. zwierciadło

4. siatka dyfrakcyjna

5. szczelina wyjściowa

6. kuweta/detektor

Komórka pomiarowa - absorpcję gazów i cieczy mierzy się w kuwetach

• dokładnie znana grubość kuwety

• odporna na działanie analizowanych substancji

• w maksymalnym stopniu przejrzysta

• z właściwego materiału:

- kwarcowe/ze stopionej krzemionki - do badań w zakresie UV

- szklane/z tworzyw sztucznych - do badań w zakresie widzialnym

Detektor - fotoelektryczny

• fotokomórka (fotokatoda)

• fotodioda (zjawisko fotoelektryczne wewnętrzne)

• fotopowielacz (fotomnożnik)

Wskaźniki, rejestratory, komputer

Spektrofotometry UV-VIS

• jednowiązkowe - w których jedna wiązka przechodzi najpierw przez układ odniesienia, a następnie (po zamianie kuwet) przez próbkę badaną

• dwuwiązkowe - wiązka promieniowania ze źródła jest dzielona na dwie równocenne wiązki przechodzące równolegle - jedna przez roztwór odniesienia, a druga przez roztwór badany. Detektor wskazuje różnice absorbancji.

Zastosowanie spktrofotometrii UV-VIS

Analiza ilościowa - pomiar absorbancji A badanego roztworu przy określonej długości fali l i wykorzystaniu zależności Lamberta-Beera:

A_= _cb

A_- absorbancja przy długości fali 

_- molowy współczynnik absorpcji przy długości fali 

c - stężenie roztworu

b - grubość warstwy

Dobór optymalnych warunków oznaczania

• dobór odpowiedniego przyrządu, kontrola jego sprawności, kalibracja

• przygotowanie próbek do pomiaru

- zapewnienie jednorodności roztworu

- dobór odpowiedniego rozpuszczalnika

- ustalenie optymalnego pH analizowanego roztworu

- dobranie odczynnika kompleksującego (w przypadku oznaczania kationów metali w postaci barwnych związków chelatowych)

• wybór analitycznej długości fali

Analityczna długość fali

• najczęściej do oznaczeń ilościowych wybiera się długość fali odpowiadającą najbardziej intensywnemu pasmu absorpcji, czyli _max

• jeżeli oprócz substancji badanej absorbuje także rozpuszczalnik wybiera się niższe pasmo absorpcji, ale położone w zakresie małej absorpcji rozpuszczalnika

• analityczną długość fali należy wybierać przy plateau krzywej, a unikać długości fali na stromych odcinkach krzywej

Oznaczanie pojedynczego składnika

• metoda porównania z pojedynczym wzorcem

A_bad c_bad

=

A_wz c_wz

• metoda porównania z kilkoma wzorcami, czyli metoda krzywej wzorcowej

• metoda dodatku wzorca

Analiza jakościowa - elektronowe widmo absorpcyjne jest cechą charakterystyczną związku chemicznego. Do charakterystyki widma wykorzystuje się:

• _max

• _max

Ustalanie zależności strukturalnych i identyfikacja grup funkcyjnych.

Chromofory - grupy absorbujące promieniowanie elektromagnetyczne w zakresie 180 - 800 nm. Typowe chromofory:

>C=C< chromofor alkenowy

chromofor benzenowy

>C=O chromofor karbonylowy

-N=N- chromofor azowy

>C=S chromofor tiolowy

-N=O chromofor nitrozowy

Auksochromy - są to grupy przesuwające absorpcję w kierunku fal dłuższych (tzw. przesunięcie batochromowe). Na przykład grupy:

• hydroksylowa

• aminowa

• sulfhydrylowa

SPEKTROFLUORYMETRIA

Luminescencja = emisja światła przez ciała zimne. Cząsteczki wzbudzone emitują promieniowanie, przechodząc do stanu podstawowego.

Rodzaje luminescencji:

• fotoluminescencja - substancja jest wzbudzona promieniowaniem UV-VIS

• chemiluminescencja - wzbudzenie cząsteczki jest wynikiem reakcji chemicznych

• bioluminescencja - wzbudzenie cząsteczki w wyniku procesów biochemicznych

• elektroluminescencja - wzbudzenie cząsteczki następuje w polu elektrycznym

Fotoluminescencja - w zależności od mechanizmu przejść elektronowych wyróżniamy fluorescencję i fosforescencję

X + hn -> X* -> X + ciepło + fosforescencja

fluorescencja

• pasmo fluorescencji i jego maksimum są przesunięte w stronę fal dłuższych względem pasma absorpcji

• pasma absorpcji i fluorescencji częściowo się nakładają

• występuje proporcjonalność między fluorescencją i natężeniem światła wzbudzającego

Spektrofluorymetr

źródło wybór długości fali I₀

promieniowania promieniowania próbka

UV-VIS wzbudzającego

90^° I_E

wybór długości fali

rejestrator detektor promieniowania

komputer emitowanego

Spektrofluorymetria:

• 10²-10⁴ większa czułość w porównaniu ze spektrofotometrią UV-VIS

• lepsza selektywność - tylko określona grupa związków wykazuje fluorescencję

Zastosowanie spektrofluorymetrii - do analizy:

• witamin, hormonów, alkaloidów, aminokwasów, białek

• leków (antybiotyki, barbiturany)

• środków spożywczych (węglowodany, tłuszcze)

• substancji toksycznych w środowisku (wielopierścieniowe węglowodory aromatyczne)

7

---