Laboratorium 7.

Barwienie bakterii

Testujemy / hodujemy nieznaną bakterię :
1. Opisujemy, jak rośnie w podłożu płynnym;
2. Robimy posiew redukcyjny;
3. Wykonujemy barwienie metodą Grama;

Barwienie drobnoustrojów
mureina - podstawa ściany komórkowej u większości bakterii;
2 półświaty bakterii w oparciu o barwienie metodą Grama:
GRAMDODATNIE: barwią się na ciemny kolor (niebieskofioletowy, może wyglądać jak czarny pod mikroskopem) - mają grubą warstwę mureiny, która zatrzymuje w komórce kompleks fioletu krystalicznego i płynu Lugola;
GRAMUJEMNE: mało mureiny, więc etanol wypłuka fiolet i komórka przyjmie drugi barwnik- fuksynę;

GRAMDODATNIE:
Zdecydowana większość ziarniaków (kulkowate bakterie), zwykle nazwy rodzajowe ziarniaków kończą się na -coccus;
przykłady:
Staphylococcus aureus (gronkowiec złocisty) - w koloniach tworzy grona :

Micrococcus Luteus (żółty ziarniak) - pakietowiec:

paciorkowce, np. Streptococcus Pyogenes (angina)

Inne ziarniaki, np. Neisseria gonorrhoeae (dwoinka rzeżączki) nie barwi się na fioletowo, tylko na czerwono.
Wszystkie laseczki sa gramdodatnie (zawsze też są przetrwalnikujące):
2 rodzaje:
- tlenowe, np. Bacillus Subtilis (laseczka sienna)
Bacillus Cereus (laseczka woskowa) - wytwarza toksyny, lubi żyć w ryżu, może powodować biegunkę;
-beztlenowe, tu jeden ważny rodzaj: Clostridium,
np. Clostridium Botulinum (laseczka jadu kiełbasianego) - najsilniejsza trucizna świata (z odkrytych do tej pory), działa na przekaźniki nerwowe (przestają być przekazywane sygnały przestają pracować mięśnie umiera się na skutek uduszenia); inne zastosowanie: botoks (trzeba go powtarzać co jakiś czas, bo organizm rozkłada truciznę);
Clostridium Perfringens (laseczka zgorzeli gazowej) - gangrena (martwica spowodowana odmrożeniem/ zranieniem, głównie dotyczy otwartych ran zabrudzonych ziemią); wytwarza bardzo dużo produktów gazowych, dlatego (zwykle) kończyna puchnie do ogromnych rozmiarów i tkanki pękają amputacja (jeśli stan jest bardzo wczesny [kilka godzin!] to można stosować antybiotyki);

GRAMUJEMNE:
Większość pałeczek, np.:
- Escherichia Coli
- Serratia Marcescens
- Salmonella Typhi (pałeczka salmonellozy)
- Shigella (pałeczka czerwonki)
- Klebsiella Ozoenae (wchodzi np. do nosa traci się węch na zawsze)
Grupa Pseudomonas (piękne kolory- od szmaragdów po zielenie), np. Pseudomonas aeruginosa (pałeczka ropy błękitnej) - błękitnoszmaragdowa, ważna i wredna - nic na nią nie działa, jest bardzo oporna, powoduje poważne zakażenia w szpitalach; powoduje długoletnie zapalenia zatok;
Pseudomonas Fluorescens - biodegradacja gruntów (usuwanie zanieczyszczeń z gleb i wód - biotechnologiczne usuwanie ropopochodnych, także P. putida);
Pseudomonas Putida;
rozpyla się je, ponieważ jedzą wszystko (usuwają mnóstwo szkodliwych, antropogenicznych zanieczyszczeń), łatwo się adaptują, ale ciężko je zabić, grupa ważna biotechnologicznie (antybiotyki i bioremediacja);

Ćwiczenia:

1. Przygotować dwa preparaty barwione metodą Grama - jeden dla bakterii gramdodatnich (Micrococcus Luteus), a jeden dla gramujemnych (E. Coli):
- odtłuścić szkiełki podstawowe etanolem / mydłem i wytrzeć szmatką do sucha;
- nanieść 2 ezy płynu fizjologicznego (0,9% NaCl)
- nanieść bakterie:
· wyżarzyć ezę w ogniu
· pobrać odrobinę (bardzo mało) bakterii
· wymoczyć ezę w naniesionym płynie i dokładnie rozsmarować po całym szkiełku
- wysuszyć bardzo dokładnie szkiełko (na powietrzu lub suszarką do włosów) - tutaj NaCl spełnia dwie role: 1. środowisko izotoniczne, 2. widać, czy preparat jest dobrze wysuszony - jeśli tak, to widać wysuszoną sól na płytce;
- utrwalić preparat - przejechać 3 razy nad ogniem trzymając płytkę za krawędź w prawej ręce kciukiem i palcem wskazującym, podtrzymując serdecznym, za każdym razem dotykając lewej dłoni, by sprawdzić, czy płytka jest ciepła;
- barwienie w wanience:
· nalać na szkiełko fiolet krystaliczny i trzymać go 3 minuty;
· spłukać wodą z tryskawki;
· nalać płynu Lugola i barwić 1,5 minuty;
· spłukać wodą;
· odbarwić w alkoholu - nalać na szkiełko etanol i odczekać 20 sekund, wylać - powtórzyć 3 razy;
· spłukać wodą;
· dobarwić barwnikiem kontrastującym - nalać fuksyny, barwić 30 sekund;
· spłukać wodą;
· położyć preparat na bibułę i wytrzeć go poprzez dociskanie bibuły - do sucha;

2. Przygotować preparat przyżyciowy (pomarańczowe bakterie z powietrza):
- odtłuścić szkiełko jw.;
- nanieść 2 ezy płynu fizjologicznego jw.;
- nanieść materiał biologiczny jw.;
- przykryć szkiełkiem nakrywkowym;
- obejrzeć
Nie może długo leżeć, bo szybko wysycha!

TEORIA:
Morfologia komórki bakteryjnej - barwienie bakterii

Trzy podstawowe kształty bakterii:
- kuliste / elipsoidalne
- cylindryczne / pałeczkowate
- spiralne / śrubowate

Zależnie od przebiegu płaszczyzny podziału podczas rozmnażania się pojedynczej komórki, komórki potomne układają się w pewien ustalony sposób:
- ziarniaki
- dwoinki
- czworaczki
- sześcianki
- paciorkowce
- gronkowce

Wymiary bakterii: 0,5 - 5,0 μm.

Typową postać dla każdego gatunku mają młode komórki, hodowane w optymalnej temperaturze, na podłożu bogatym w substancje odżywcze. Kształt może jednak odbiegać od norm fizjologicznych (inwolucja bakterii). Formy te powstają najczęściej po wyczerpaniu związków odżywczych i nagromadzeniu szkodliwych produktów przemiany materii (np. formy kuliste przybierają wtedy postac wielkich kul).

Mała zdolność bakterii do załamywania promieni świetlnych słaba widoczność pod mikroskopem bakterie ogląda się po zabarwieniu.

Do barwienia stosuje się zwykle barwniki zasadowe lub czasami obojętne / kwaśne. Wynika to z budowy i składu chemicznego błony i ściany komórkowej i znacznej zawartości kwasów nukleinowych i białek w cytoplazmie (główne składniki pochłaniające barwniki).

Większośc bakterii wymaga podłoża o pH bliskiego obojętnemu / lekko zasadowego. Komórki mają wtedy ładunek ujemny, więc łączą się ze związkami, których części barwne mają ładunek dodatni.

Najczęstsze barwniki:
- fiolet krystaliczny
- fiolet goryczkowy
- błękit metylenowy
- fuksyna

Typy barwienia:
- pozytywne (częściej stosowane)- zabarwione bakterie na jasnym tle; utrwalanie przeprowadzane czynnikami fizycznymi (ogrzewanie szkiełka w płomieniu) lub chemicznymi (metanol, etanol) zabija komórki, umożliwiając wniknięcie barwnika;
- negatywne - obserwacja niezabarwionych komórek na zabarwionym tle;

Barwienie proste - wprowadzenie do komórki jednego barwnika, daje informację tylko o kształcie komórki;

Barwienie złożone - używa się kilku barwników;

Barwienie przyżyciowe - do badania np. przepuszczalności błony cytoplazmatycznej, w celu odróżnienia komórek żywych od martwych; wprowadza się nietoksyczny barwnik;

Metoda Grama - barwienie komórek fioletem krystalicznym, utrwaleniu płynem Lugola, odbarwieniu alkoholem i dobarwieniu barwnikiem kontrastującym;

Bakterie:
- gramdodatnie - zatrzymują barwnik podstawowy (fiolet) po utrwaleniu płynem Lugola (roztwór jodu w jodku potasu, tworzy z fioletem kompleks) i nie odbarwiają się alkoholem;
- gramujemne - nie zatrzymują kompleksu „fiolet - płyn Lugola”, odbarwiają się w alkoholu i przyjmują barwnik kontrastowy;

Kwasooporność - cecha charakterystyczna rodzaju Mycobacterium i niektórych promieniowców; za substancję warunkującą w największym stopniu uważa się kwas mykolowy występujący w ścianie i cytoplazmie;
Wprowadzenie barwnika do komórek bakterii kwasoodpornych wymaga stosowania metod drastycznych, np. użycia stężonego roztworu fuksyny na gorąco. Zabarwione komórki nie odbarwiają się pod wpływem mocnych kwasów, np. HCl, H₂SO₄. Dobarwienie preparatu barwnikiem kontrastowym pozwala oglądać np. zabarwione na czerwono prątki.

+ Anatomia i cytologia bakterii!

---