Hybrydyzacja „in situ”:

-oparta na zasadzie komplementarności nici DNA

-Rodzaje: barwna (z peroksydazą i nadtlenkiem wodoru); izotopowa (radioaktywna); fluorescencyjna.

FISH:

Może być wykonywana do:

-chromosomów metafazowych

-chromosomów pro metafazowych

-jąder interfazowych

-rozluźnionych włókien chromatynowych

Rodzaje:

-jedno-, dwu-, i wielokrotna (M-FISH) fluorescencyjna hybrydyzacja in situ

-malowanie chromosomów

-COD-FISH

-PRINTS

-CGH.

Sondy molekularne – to fragmenty DNA sklonowane w różnych wektorach (plazmidy, kosmidy, BACi)

Typy sond:

a)Sondy locus-specyficzne

b)Sondy centromerowe

c)Sondy telomerowe

d)Sondy specyficzne dla obszarów jąderko twórczych (NOR)

e)Sondy malujące

-inne: np. stanowiące całkowity genomowy DNA, cDNA, RNA, syntetyczne oligonukleotydy

Źródła sond:

-mikrodysekcja chromosomów

-sortowanie w cytometrze przepływowym

-amplifikacja wybranych sekwencji w reakcji PCR.

Jakość uzyskiwanego sygnału hybrydyzacyjnego.

Etapy FISH:

-przygotowanie preparatów cytogenetycznych

-przygotowanie sond molekularnych, w tym znakowanie

-denaturacja preparatów i sondy

-hybrydyzacja sondy z chromosomami

-detekcja związanej sondy

-obserwacja miejsca hybrydyzacji i identyfikacja chromosomu.

Znakowanie sondy:

*bezpośrednie – nukleotydy DNA sprzężone z fluochromami (FITC – zielony; Texas Red – czerwony)

*pośrednie –nukleotydy DNA sprzężone z biotyną (brak barwy) lub digoksygeniną (brak barwy).

Detekcja sygnału w znakowaniu:

a)bezpośrednim: sonda wyznakowana nukleotydem sprzężonym z barwnikiem przyłącza się do chromosomów w mikroskopie fluoroscencyjnym pod wpływem światła UV wzbudzamy fluoroscenjce i obserwujemy sygnał świetlny.

b)pośrednia: chromosomy połączone z sondą zawierającą nukleotyd z biotyną dodajemy kompleks awidyna + barwnik fluoroscencyjny na to dajemy przeciwciało anty-awidyna, a na przeciwciału kolejna porcja awidyny z barwnikiem. Znów w mikroskopie pod wpływem UV wzbudzamy fluorescencje.

Znakowanie sond:

*Nick-translacja:

-Składniki: sonda, mieszanina nukleotydów + nukleotyd znakowany, 2 enzymy: DN-aza i polimeraza o dwóch aktywnościach.

-Przebieg reakcji: na początku DNaza nacina dwuniciową cząsteczkę sondy, w miejscu przecięcia przyłącza się polimeraza, aktywność egzonukleazowa usuwa nukleotydy z sondy, aktywność elongacyjny dobudowuje nić komplementarną nukleotydów dodanych do rekcji włączając w to nukleotyd znakowany.

*Random-priming:

-Składniki: sonda, mieszanina nukleotydów + nukleotyd znakowany, 1 enzym: polimeraza tlenowa, startery.

-Przebieg: denaturacja sondy i starterów, przyłączenie starterów (niespecyficznie) do sondy, przyłączenie polimerazy dobudowanie nici komplementarnej już z znakowanym nukloetydem.

*PCR:

-składniki: sonda, primery , nukleotydy i nukleotyd znakowany, enzym: polimeraza bufor, woda

-Etapy: denaturacja, przyłączenie primerów, starterów, przyłączenie polimerazy, odbudowanie nici komplementarnej.

Random-priming – przygotowanie sondy:

-optymalna długość fragmentów DNA do hybrydyzacji wynosi 200-500 pz.

-przygotowanie DNA do znakowania np. w metodzie R-P trawienie DNAzą

-ekstrakcja DNA mieszaniną fenol: chloroform: alkohol izoamylowy w stosunku 25:24:1 pH=8,0

-reakcja znakowania metodą R-P

-ekstrakcja DNA

-mieszanina hybrydyzacyjna : (ssDNA,+ cot1DNA) = kompetytor (blokuje sekwencje powtarzalne w sondzie).

Rola kompetytora: blokowanie sekwencji powtarzalnych w sondzie w celu zwiększenia specyficzności hybrydyzacji sondy z chromosomami.

Identyfikacja miejsca hybrydyzacji:

Identyfikacja na podstawie wzoru prążkowego po barwieniu chromosomów:

-przed hybrydyzacją – barwienie QFQ (barwa zielona) i zapis płytek metafazowych, następnie od płukanie kwinaryny i wykonanie FISH, obserwacja miejsca hybrydyzacji

-po hybrydyzacji – wykonywanie FISH i barwienie DAPI (barwa niebieska)lub jodek propidionu (na czerwono).