Klonowanie molekularne

Co to jest klonowanie - powstawanie lub otrzymywanie genetycznie identycznych czasteczek DNA , komorek, organizmow

Klonowanie DNA - namnazanie zrekombinowanej czaeteczki DNA w komorkach odpowiedniego gospodarza

Co się dzieje z nagim fragmentem DNA wproewadzonym do komorki bakteryjnej? - dzialaja na nią enzymy restrykcyjne

Zeby tego uniknac dolaczamy DNA do wektora, co powoduje, ze bakteria rozpoznaje dane DNA jako swoje

Wektor - umozliwia wprowadzenie obcego DNA do komorek gospodarza i nastepnie jego namnozenie i / lub ekspresję

Wektor posiada zdolnosc do powiuelania się w komorce bakteryjnej, jest czasteczka dna ktora posiada zdolnbosc do autonomicznej replikacji w danym typie komorki

Klonowanie moze dostarczyc czystej próbki pojedynczego genu - oddzielonego od wszystkich pozostalych genow komorki. Mimo ze zestaw klonow moze zawierac wiele roznych zrekombinowanych czasteczek, to pojedynczy kloin zawsze zawiera liczbe kopie tylko jednej

Subklonowanie - to przeniesienie fragmentu DNA z jednego wektora do drugiego wektora, wykorzystujemy to np do bardziej szczegolowego zbadania ktorkiego regionu uprzednio sklonowanego wiekszego fragmentu DNA, lub tez do prezeniesienia genu do wektora, ktory umozliwi jego ekspresję w komorkach danego gatunku

Co trzeba mieć, aby klonować?- DNA, ktory ma byc sklonowany, wektor, dzieki ktoremu DNA zostanie wprowadzony do organizmu, komorki gospodarza, metode przylaczania DNA z wektorem, sposob wprowadzenia DNA polaczonego z wektorem do komorki gospodarza, test- ktore komorki pobraly zrekombinowany wektor (czyli wektor i DNA)

Żrodła DNA do klonowania: caslkowity, genomowy DNA (biblioteka genomnowa), calkowity mRNA w forimie cDNA (biblioteka cDNA), produkt reakcji PCR

Bibioteki genomnowe - zestawy klonow DNA, z ktorych kazdy powstal poprzez wlaczeniie do wektora innego fragmentu DNA, ktory nastepbnie zostal namnozony w komorkach gospodarza

Bibioteki cDNA - kontruowane na bazie mRNA, ktore pochodzi z komorki lub tkanki w ktorej zachodzi ekspresja poszukiwanego genu, na matrycy mRNA syntetyzowane jest cDNMA (reakcja zachodzi przy udziale enzymu odwrotna transkryptaza)

Cechy dobrego wektora: nieiwelka czasteczka DNA, ma zdolnosc wydajnej, autonomicznej replikacji w odpowiednim gospodarzu, iostnieje mozliwosc wyizolowania wektora niezaleznie od genomu gospodarza, latwy do przechowywania i testowania, nie posiadajacy niebezpiecznych genow, nie zaklocajacy funkcji zyciowych gospodarza

wektor musi takze posiadac 3 okreslone sekwencje zeby wgl byl uzyty do badan. pierwszym jest polilinker, czyli miejsce wielokrotnego klonowania, obecnosc tej sekwencji pozwala na rozpoznanie przez restryktazy, musi byc marker selekjcyjny, ktory umozliwia wybor ktore przyjely wektor zrekombinowany, niezrekombinowany a ktore wgl nie przyjely, i musi miec sekwencję ORI, ono decyduje o specyficznosci wektora, inicjuje replikację

rodzaje wektorow bakteryjnych: plazmidy(15kpz), wektory fagowe(25kpz), kosmidy(40 kpz), BAC-i(500kpz), YAC-i (1 Mpz), wazna cecha charakteryzującą wektory jest ich pojemnosc, ktora decyduje o wielkosci wprowadzonego DNA (wielkosc klonowanego insertu)

Formy plazmidów - kolista zrelaksowana- OC, liniowa, kolista superhelikalna (superskręcona)- CCC, odroznia się je na zelu, bo forma kolista zrelaksowana wedruje najwolniej na zelu agarazowym, superhelikalna najszybciej

Komnorki bhiorocow - komorki prokariotyczne (najczesniej szczepy e. coli), proste komorki eukariotyczne ( drozdze), inne'

wiekszosc wektorow jest charakterystyczna dla danego typu komorek, isrtnieja jednak tzw wektory bifunkcyjne, dla ktorych gospodarzami moga byc zarowno komorki eukariotyczne i jak prokariotyczne

Jak polaczyc wstawkę z wektorem? - jezeli polimeraza po reakcji PCR dodaje dodatkowa A na koncu produktu, a wektor wystepuje w formie liniowej wtedy mozemy latwo polaczyc wektor z dna, tylko nie wiemy w ktora strone wektor się przylaczy, najczesciej mamy wektory koliste, ktore trzeba przeciac naby wprowadzic dna - dzialamy wiec restryktazami na wektor i insert

Ligacja - czyli polaczenie frgamentu DNA (wstawki) z wektorem, w tym celu stosuje sie enzym ligaza, katalizujacy formowanie wiazan fosfodiestrowych miedzy koncem hydroksylowym 3' a koncem fosforanowym 5' dwoch sasiadujacych nukleotydow w lancuchy dna, najczesniej stosowanym enzymym jest ligaza faga T4

Fosfataza alkaliczna - katalizuje usuwanie grup 5' fosforanowych z DNA, RNA i trifosforanow, umozliwia defosforylację koncow wektorea do klonowania --> fragmenty, ktore sa pozbawione grup fosforanowych na koncach nie moga się zamykac w kolko w rekacji ligacji, ligacja ze wstrawką jest mozliwa--> grupa fosforanowa

Insert moze wklonowac się do plazmidu w kierunku pozadanym, jak i odwrotnie. w jaki sposob zwiekszyc szansę prawidlowego kierunku wklonowania? - mozna uzyc dwoch enzymow restrykcyjnych

wektor : insert ratio; okredsla ile nalezy dac wektora a ile wstawki, najczesniej stosowane to 1:1, 1:3, 1:5, wzor na obliczenie ilosci wstawki, by uzyskac odpowiednia proporcję jest nastepujacy:

wektror (ng)x insert (bp)/wektor (bp) x stosunek molowy insert/wektor

Wprowadzenie zrekombinowanych czasteczek do komorki gospodarza: w p0rzypadku komoreki bakteryjnych proces ten nosi nazwę transformacji, natomiast eukariotycznych - transfekcji

u niektorych bakterii proces pobierania przez komorki dna z podloza zachodzi w sposob naturalny - w odpowiednich warunkah fizjologicznych osiagaja tzw stan kompetencji, co oznacza ze sa zdolne pobrac dna

stan kompetencji charakteryzuje sie zzwiekszona przepuszczalnoscią blony komorkowej, moze zostac wymuszony - osiagane jest to poprzez inkubację bakterii w np chlorku wapnia w warunkach obnizonej temperatury

sposoby transformacji komorek bakteryjnych:

- elektroporacja - polega na pobieraniu DNA po zadzialaniu na komorki bakteryjne krotkim impulsem elektrycznym

- heat shock - inkubacja komorek w 42 stopniach celsjusza, następnie gwałtowne schlodzenie

transformacja w e. coli: zachodzi z niską wydajnością, zalezy od rodzaju DNA - najwyzsza jest dla formy CCC, nizsza dla OCm najnizsza dla liniowej, najczesaciej do jednej komorkji bakteryjnej wnika jedna czasteczka DNA

pozostale czynniki wplywajace na wydajnosc transformacji w e. coli: uzyty szczep bakterii, faza wzrostu komorek (najlepiej logarytmiczna), ilosc wielkosc DNA uzytrego do transformacji, czas inkubacji DNA z komorkami kompetentnymi, czas trwania heat shock, uzytej metody; szacxuje sie ze dla elektroporacji z 1 mikrograma dna otrzymmy 10 do 10 transformantow, a dla heat shock 10 do 6 transformantow

selekcja transformatorow: geny markerowe wektora umozliwiaja odroznienie komorek bakteryjnych ktore pobraly wektor, od tych ktore nie pobraly oraz odroznienie ktore bakterie pobraly wektor z insertem, a ktore wektor bez inseerru

markerami mogą byc: geny odpornosci na antybiotyk, markery histochemiczne (riozne zabarwienie kolonii), markery pokarmowe (mozliwy wzrost na pozywce bez skladnika odzywczego, normalnie niezbędnego)

selekcja w opraciu o antybiotyk: bakterie wysiewane na pozywke stala z antybiotykiem, bakterie ktore posiadaja wektor z genem kodujacyn enzym rozkladajacy dany antybiottyk, w efekcie jedynie bakterie, ktore pobraly wektor beda w stanie rosnac na pozywce z antybiuiotykiem, hodowla trwa do uzyskania pojedynczych kolonii- kolonia wpowstaje wwyniku podzialow jednej, dlatego genotyp komorek wchodząścych w sklad kolonii jest identyczny

selekcja z wykorzystaniem LacZ: umozliwia rozoroznienie komorek zawierajacych zrekombinowany wektor od komorek, ktore posiadaja pusty wektor, gen LacZ koduje enzym beta-galaktozydazę, ktory rozklada cukier X-gal na dwa cukry skladowe,z ktorych jeden ma niebieski kolor

zastosowanie klonowania w wektorach:

-nam,nazanie i przechowwywanie bardzo dlugich fragmentow DNA np bibliotejki cDNA,

genomowe

-sekwencjonowanie fragmentow o calkowicie nieznanej sekwencji - startery komplementarne do wektora

- wektory ekspresyjne - badanie funckji genow, produukcja rekombinowanych bialek np ludzkiego hormonu wzrostu lub insuliny

- terapia genowa

Izolacja plamidu: kazda z metod wykorzystuje roznice miedzy dna genomowym a dna plamidowym bakterii; dna genomowy jest wiekszy niz plamidowy, podczas procedury izlolacji dna genomowy zostaje zniszczony a dna plazmidowy pozostaje w formie CCC

etapy otrzymywania plazmidowego dna: hodowla bakterii niosących plazmid, zebranie bakterii- osadzenie przez zwirowanie, liza (lizozym) aby zniszczyc bariery komorkowe, dodajemy detergenty, potem jakimis zwiazkami oddzielamy dna genomowej od plazmidowego