Fragmenty DNA pocięte restryktazą mogą był łączone z innym odcinkiem DNA
(wektorem) trawionymi tą samą restryktazą. Końce DNA badanego i wektora mogą
zostać połączone za pomocą ligazy. Wektory dzielimy na:
• Autonomiczne: replikują się niezależnie od genomu gospodarza.
• Integracyjne: włączają do jego DNA są bardziej stabilne, ale występują w
mniejszej liczbie kopii. Należą tu między innymi wektory retrowirusowe.
• Ekspresyjne: mają na celu zapewnić efektywną ekspresję wszczepianego
genu.
• Wektory wahadłowe (bifunkcjonalne): mogą występować w co najmniej
dwóch różnych organizmach, przy czym można je przenosić między komórkami
prokariotycznymi i eukariotycznymi.
Dobór odpowiedniego typu wektora zależy od rodzaju komórki, w jakiej zamierzamy
klonować dany fragment DNA. Najważniejszym funkcjonalnym elementem wektora są
sekwencje Ori, odpowiedzialne za inicjację replikacji, które muszą być odpowiednie dla
wybranego organizmu. Istotną cechą wektorów jest obecność w nich sekwencji
markerowych, kodujących np. konkretne cechy fenotypowe danego organizmu, które
dadzą się łatwo zauważyć lub geny odporności na antybiotyki.
Do najważniejszych wektorów używanych w medycynie należą:
• Plazmidy bakteryjne: pozachromosomowe cząsteczki DNA, wielkości kilku-
kilkuset tysięcy PZ, zdolne do samodzielnej replikacji u prokaryota i niektórych
eucaryota. Plazmidy są przenoszone w procesie koniugacji między komórkami
bakteryjnymi
• Wektory fagowe: są to wirusy infekujące bakterie przez aktywne
wstrzyknięcie swojego DNA do wnętrza komórek. Ich namnażanie jest bardzo
szybkie. Najlepiej poznanym jest fagλ, który może być używany jako wektor do
infekowania E. Coli. DNA faga może zostać zamienione miejscami z jakimś
odcinkiem bakteryjnego, włączając się tym samym do genomu lub wnikać do
niego na zasadzie insercji. Z kolei fag M13 ma mniejszy plazmid (6tys pz) ale nie
powoduje lizy komórki po namnożeniu.
• Kosmidy: używane w klonowaniu dużych odcinków DNA (do 45 kpz). Składają
się z sekwencji plazmidu z miejscem Ori, połączonych z sekwencją cos faga λ,
koniecznej do upakowania DNA w kapsydy.
• Wektory drożdżowe:
• Sztuczne chromosomy drożdżowe: posiadają sekwencje centromeru,
telomeru i inicjacji replikacji, które łączy się z plazmidami. Są doskonałe do
badania ekspresji genów.
• Sztuczne chromosomy bakteryjne: są bardziej stabilne od drożdżowych i
łatwiej się nimi transformuje E.Coli, a także łatwiej namnaża i izoluje.
• Wektory eukariotyczne ssaków: jednymi z pierwszych były te oparte o
wirusa SV40. zawierają one fragmenty DNA wirusa z sekwencją ori, promotory
genów kodujące wczesne białka wirusa oraz sekwencje odpowiedzialne za
inicjację transkrypcji.
• Sztuczne chromosomy ssaków
• Nośniki syntetyczne: praktyczne zastosowanie mają liposomy, czyli
cząsteczki lipidów o charakterze kationowym, zawierające egzogenny DNA
wprowadzony za pomocą plazmidu. Liposomy mogą wprowadzać odcinki DNA
o rozmiarach do 150 kpz. Charakteryzują się one niską immunogennością i dużą
pojemnością. Zmodyfikowane przez skompleksowanie z gangliozydem GM1
czyni je niewidzialnymi dla makrofagów. Innymi wektorami chemicznymi są
polipeptydy kationowe.
Terapia genowa
Polega na wprowadzeniu prawidłowego genu do komórki w której występuje on w
formie uszkodzonej lub nie występuje w ogóle. Terapia musi być poprzedzona testami
In vivo oraz In vitro. Konieczne jest użycie odpowiednich wektorów. Wskaźnikiem
sukcesu terapii jest pojawienie się ekspresji danego genu. Pacjenci poddani terapii
genowej musze pozostawać pod ścisłą kontrolą w celu oceny efektów leczenia i
wykrycia ewentualnych skutków ubocznych. Obecnie jedyną dopuszczalną metodą jest
wprowadzanie wektorów do komórek somatycznych. Modyfikacja komórek linii
płciowych jest ze względów etycznych zabroniona.
Strategie terapii genowej:
• Ex vivo: polega na pobraniu od chorego komórek do celowych i
wprowadzeniu genu In vitro. Kolejnym etapem jest ponowne wprowadzenie
komórek do organizmu.
• In vivo: polega na wprowadzeniu terapeutycznego genu bezpośrednio do
tkanek.
Rodzaje terapii genowej
• Dodawanie genów: gen uszkodzony pozstaje w swoim locus, a gen
terapeutyczny jest wprowadzony w inne miejsce chromosomu.
• Zamiana genów: polega na wymianie genu zmutowanego na gen
prawidłowy w procesie somatycznej rekombinacji homologicznej.
• „doskonalenie genomu”: dodanie genu, który nie zastępuje żadnego
innego, ale koduje substancje, które fizjologicznie nie są produkowane przez
komórkę. Mogą to być geny kodujące rybozymy, białka wirusowe i
interleukinę 2. produkty genu wprowadzonego wpływają na ekspresję innych.
Próby terapii genowej u ludzi
Do roku 2010 odbyły się 1644 próby kliniczne terapii genowe u ludzi, z czego ponad
900 przeprowadzono po roku 2000. najwięcej z nich dotyczyło chorób
nowotworowych, na drugim miejscu znalazły się choroby sercowo-naczyniowe.
Terapia genowa w niektórych chorobach
• Mukowiscydoza: próby dotyczą głównie skorygowania defektu
genetycznego komórek oskrzeli, gdyż objawy płucne są w chorobie
najgroźniejsze. Najczęstszymi wektorami są w tym przypadku adenowirusy,
ostatnio też lentiwirusy. Transgen (CFTR) w odpowiednim wektorze
wprowadza się drogą wziewną. Głównym problemem jest wprowadzenie
wektora do komórek, gdyż spotyka się on z odpowiedzią odpornościową. Z
powodu wymiany komórek nabłonka terapia musi być regularnie powtarzana.
Do przywrócenia prawidłowego stanu organizmu wystarczy 10% ekspresja
CFTR.
• Choroby układu naczyniowego: próby koncentrują się na chorobie
niedokrwiennej serca i kończyn. Z dużym sukcesem prowadzi się próby
wprowadzania genów kodujących substancję wzmagające angiogenezę, np.
VEGF czy jeszcze skuteczniejszy FGF-4. prace dotyczą też ograniczenia
restenozy (ponownego zwężenia) po angioplastyce. Stosuje się tu geny
kodujące rybozymy ograniczające proliferację mięśni gładkich, która w
nadmiarze powoduje zwężenie naczyń. Wyniki badań w kierunku walki z
miażdżycą są mniej obiecujące, co wynika z trudności w otrzymaniu
odpowiedniej ekspresji czynnika angiogennego i jego utrzymania aż do zajścia
procesu. Innym podejściem jest wszczepianie naczyń żylnych modyfikowanych
ex vivo chorym na chorobę zarostowo-zakrzepową.
• Hipocholesterolemia rodzinna: terapia przebiega ex vivo na pobranym
fragmencie wątroby przy namnożeniu hepatocytów In vitro i wprowadzeniu
do nich za pomocą retrowirusów genu kodującego receptor dla LDL, a
następnie ponownym wszczepieniu tych komórek do wątroby chorego poprzez
żyłę krezkową. Zabieg taki powtarza się trzykrotnie, ale skuteczność nie jest
wysoka.
• Choroba Parkinsona: we wszystkich próbach wykorzystuje się wektory
AAV. Pierwsze próby polegały na wprowadzeniu do jądra podwzgórza genu
dekarboksylazy kwasu glutaminowego, którego produkt pośredniczy w
syntezie GABA. Inną metodą jest wprowadzenie genu dla neuturyny, który
która pobudza różnicowanie neuronów dopaminergicznych. Trzecią opcją jest
terapia
ciała
prążkowanego
genem
dekarboksylazy
L-aminokwasów
aromatycznych.
• AIDS: pracę postępują w trzech kierunkach. Jednym z nich jest
wprowadzenie do komórek hematopoetycznych transgenu powodującego
niewrażliwość na infekcję wirusową HIV. Inną metodą jest dostarczanie
transgenu do limfocytów t CD 4i 8. trzecią metodą ma być immunizacja
antygenami wirusa HIV, która wywoła odporność na wirusa.
• Choroba Huntingtona: prace polegają na uzyskaniu nadekspresji
rzęskowego czynnika neurotroficznego CNTF, redukującego obumieranie
prążkowia. Do komory bocznej mózgu wstrzykuje się półprzepuszczalną
kapsułkę ze zmodyfikowanymi komórkami nerki chomika. Kapsułkę wymienia
się co 6 miesięcy. W pierwszych badaniach klinicznych tej metody otrzymano
zadowalające efekty. W badaniach prowadzonych u naczelnych osiągnięto
całkowitą korekcję fenotypu.
• Choroba Alzheimera: pierwsza próba, przeprowadzona w 2001 roku
polegała na wprowadzeniu do przodomózgowia komórek wykazujących
ekspresję
czynnika
wzrostu
nerwów
NGF
stymulującego
neurony
cholinergiczne. Komórki implantowane to autologiczne fibroblasty.
Terapia genowa nowotworów
• Immunoterapia: polega na uczynieniu Komorek nowotworowych
„widocznymi” dla układu immunologicznego, przez zmodyfikowanie ich
genami kodującymi cytokin takie jak TNFα. Prowadzi to do zwiększenia
prezentacji antygenów przez komórki nowotworowe i w efekcie rekrutacji
specyficznych limfocytów T i B.
• Wirusy onkolityczne: wektory tego typu wybiórczo niszczą komórki
nowotworowe, pozostając nieszkodliwe dla prawidłowych. Wirusy namnażają
się w komórkach nowotworowych i po jej rozpadzie atakują kolejne. W
pierwszej próbie wykorzystano zmodyfikowane wirusy, namnażające się w
komórkach pozbawionych białka p53. innym wykorzystywanym wirusem jest
zmodyfikowany Hermes simplex stosowany w raku piersi i trzustki.
• Kompensacja mutacji: polega na inhibicji funkcji onkogenu i
przywróceniu funkcji genu supresorowego dzięki:
o Zatrzymaniu transkrypcji onkogenu przy pomocy antysensownych
oligonukleotydów tworzących strukturę podwójnej helisy
o Zatrzymania
translacji
mRNA
określonego
onkogenu
przez
zastosowanie jak wyżej antysensownych sekwencji
o Zablokowanie funkcji onkoprotein
o Zastąpienie zmutowanych form genów p53, czy RB1 niezmutowanymi.
• Terapia stosująca geny samobójcze: jest to przykład molekularnej
chemioterapii. Próby kliniczne obejmują:
o Transfer genu kinazy tymidyniowej zwiększającej podatność na aciklovir
o Transfer genu deaminazy cytozynowej, powodujący podatność na 5-
fluorocytozynę
o Transfer genu cytochromu P450 2B wzmacniający podatność na
cyklofosfamid.
Ogółem geny samobójcze kodują produkty, które przekształcają podany do
organizmu substancję (prolek) w trujące metabolity indukujące apoptozę.
Produkty toksyczne mogą też być niebezpieczne dla zdrowych komórek
sąsiednich. Dzięki tej metodzie dokonano przełomu w walce z glejakiem mózgu.