Zakład Genetyki Medycznej

Terapia genowa

Michał Pietrusiński

Uniwersytet Medyczny w Łodzi

Łódź 2006

Zakład Genetyki Medycznej

Technologia klasycznej terapii genowej

1. Geny:
• Mogą zostać wprowadzone do komórek gospodarza drogą

bezpośrednią lub pośrednią

• Mogą zintegrować się z genomem gospodarza lub pozostać poza

genomem

2. Główne podejścia wprowadzania genów w terapii genowej do komórek

gospodarza:

• Transfer ex vivo
• Transfer in vivo

Zakład Genetyki Medycznej

Transfer ex vivo

1. Celem uniknięcia reakcji autoimmunologicznej komórki pobiera się od

gospodarza

2. Transfer sklonowanych genów do komórek hodowlanych
3. Selekcja zrekombinowanych komórek na podłożu wzrostowym in vitro
4. Wprowadzanie zrekombinowanych komórek z powrotem do organizmu

gospodarza

5. Przykłady: komórki skóry; podobieństwo do transplantacji komórek np.

przeszczep szpiku kostnego

Zakład Genetyki Medycznej

Transfer in vivo

1. Transfer sklonowanych genów bezpośrednio do komórek gospodarza
2. Stosowany w przypadku, gdy komórek nie można hodować in vitro np.

komórki nerwowe lub komórek nie można z powrotem efektywnie
wprowadzać do organizmu gospodarza

3. Konieczność stosowania wektorów:
• wirusowych
• nie-wirusowych

Zakład Genetyki Medycznej

Zakład Genetyki Medycznej

Podstawy

1. Efektywny transfer sklonowanych genów do komórek, celem wywołania

ekspresji na możliwie wysokim poziomie

2. Wielkość wprowadzanego fragmentu bardzo ograniczona – zasadność

stosowania cDNA flankowanego silnymi sekwencjami promotorowymi

3. Po transferze, geny mogą zintegrować się z genomem gospodarza lub

pozostać niezintegrowane (episomy)

Zakład Genetyki Medycznej

Geny zintegrowane z chromosomem

1. Zalety:
• Replikacja obcego genu wraz chromosomem podczas podziału komórki
• Wszystkie komórki potomne zawierają sklonowany gen
• Łatwość uzyskania długoterminowej ekspresji sklonowanego genu
• Przykłady: tkanki złożone z komórek aktywnie dzielących się – komórki

macierzyste

2. Wady:
• Insercja sklonowanych genów zachodzi w dowolnych miejscach (różnych

dla poszczególnych komórek)

• Ekspresja na zmiennym poziomie na skutek umieszczenia genu w silnie

skondensowanym regionie heterochromatynowym

• Śmierć komórki
• Indukcja procesu karcenogenezy – aktywacja onkogenu, inaktywacja genu

supresorowego lub apoptotycznego

Zakład Genetyki Medycznej

Geny niezintegrowane z chromosomem

• Problem z uzyskaniem wysokiej ekspresji wprowadzonego genu – nie

wszytkie komórki potomne odziedziczą klon

• Konieczność wielokrotnego powtarzania terapii
• Aplikacja techniki do komórek nie dzielących się

Zakład Genetyki Medycznej

Zakład Genetyki Medycznej

Wektory wirusowe

1. Onkoretrowirusy
2. Adenowirusy
3. Wirusy adeno-associated
4. Wirusy HSV (Herpes simplex-opryszczka)
5. Lentiwirusy

Zakład Genetyki Medycznej

Porównanie wybranych cech wektorów

wirusowych

cecha

Onkoretro-

wirusy

Adenowirus

y

Adeno-

associated

Lentiwirusy

Liposomy

Wielkość

wstawki

7-7.5kb

>30kb

4.0kb

7-7.5kb

Bez

ograniczeń

Integracja do

chromosomu

Tak

Nie

Tak/Nie

Tak

Znikoma

Czas ekspresji

in vivo

Krótki

Krótki

Długi

Długi

Krótki

Stabilność

Dobra

Dobra

Dobra

?

B.dobra

Droga

transferu

Ex vivo

Ex vivo/in

vivo

Ex vivo/in

vivo

Ex vivo/in

vivo

Ex vivo/in

vivo

Stężenie

(cząstek/ml)

>

>

>

>

Nieograniczo

ne

Łatwość

hodowli

Łatwa

Łatwa

Trudna

?

Łatwa

Odpowiedź

immunologicz

na

Niewielka

Silna

?

Niewielka

Wcale

Aspekty

bezpieczeńst

wa

Mutageneza

Odp.

Immunol.
Toksyczność

Odp.

Immunol.
Toksyczność

Mutageneza

Wcale

10

8

10

11

10

12

10

8

Zakład Genetyki Medycznej

Mechanizm działania wektorów

retrowirusowych

Zakład Genetyki Medycznej

Mechanizm działania wektorów

adenowirusowych

Zakład Genetyki Medycznej

Nie-wirusowe wektory stosowane w terapii

genowej

1. Liposomy
2. Bezpośredni transfer/bombardowanie cząsteczkami – np. komórki mięśniowe
3. Endocytoza zależna od receptora

Zakład Genetyki Medycznej

Liposomy

Zakład Genetyki Medycznej

Endocytoza

Zakład Genetyki Medycznej

Terapia genowa a choroby dziedziczne

1. Najłatwiejszy cel: choroby monogenowe dziedziczące się w sposób

autosomalny recesywny bo:

• Najczęstsze mutacje prowadzą do utraty funkcji
• Chorzy maja zmutowane oba allele – całkowity lub prawie całkowity zanik

ekspresji genu

• Heterozygoty posiadając ekspresje na poziomie 50% to asymptomatyczni

nosiciele

• W wielu przypadkach ekspresja genu na bardzo małym poziomie może

przywrócić fenotyp prawidłowy

• W przypadku chorób autosomalnych dominujących mutacja utraty funkcji

w jednym locus chromosomowym (50%) może prowadzić do silnych
objawów chorobowych

Zakład Genetyki Medycznej

Konsekwencje spadku poziomu stężenia

HGPRT

Poziom aktywności HGPRT (w % w

stosunku do normalnego)

Fenotyp

>60

Normalny

8 – 60

Neurologicznie normalny, hiperurikemia

1,6 – 8

Neurologicznie z problemami

1,4 – 1,6

Zespół Lescha – Nyhana, inteligencja w

granicach normy

<1,4

Klasyczny zespół Lescha – Nyhana,

opóźnienie umysłowe

Zakład Genetyki Medycznej

Pierwszy eksperyment – niedobór deaminazy

adenozyny (ADA)

1. 14.09.1990 – 4 letnia dziewczynka
2. ADA
• Degradacja kwasów nukleinowych,
• Enzym „housekeeping”
• Brak ADA upośledza limfocyty T i prowadzi do ostrego złożonego

niedoboru odporności (SCID)

• Gen małych rozmiarów, dobrze poznany
• Limfocyty T łatwe do hodowli in vitro – transfer ex vivo
• Kontrola regulacji ekspresji na niskim poziomie

Zakład Genetyki Medycznej

Zakład Genetyki Medycznej

β-talasemia – zaburzenie syntezy łańcuchów

globiny w hemoglobinie

1. Gen β-globiny (HBB )
• Gen niewielkich rozmiarów, dobrze poznany
2. Dziedziczenie autosomalne recesywne
3. Skomplikowane mechanizmy kontroli sterujące ekspresją genów
• Poziom β-globiny musi być równy poziomowi α-globiny
• Przewaga β-globiny na rzecz α-globiny prowadzi do ujawnienia fenotypu α-

talasemii

Zakład Genetyki Medycznej

Rodzinna hipercholesterolemia

1. Defekt receptorów LDL normalnie syntetyzowanych w wątrobie -

miażdżyca

2. Dziedziczenie autosomalne dominujące
3. 50% chorych heterozygotycznych mężczyzn umiera przed 60 r. życia
4. Osobniki homozygotyczne umierają we wczesnym dzieciństwie
5. Hepatocyty
• Odporne na infekcje retrowirusami
• Łatwe do hodowli in vitro – transfer ex vivo
• Mogą być wprowadzane bezpośrednio przez system żył łączących jelita z

wątrobą

• Po zastosowaniu terapii stosunek LDL/HDL ulega zmniejszeniu i

utrzymuje się przez długi czas

• Zabieg wiąże się z wycięciem fragmentu wątroby

Zakład Genetyki Medycznej

Mukowiscydoza

1. Dziedziczy się w sposób autosomalny recesywny
2. Wiąże się z defektem transportu jonów chlorkowych w komórkach

nabłonkowych

3. Ekspresja genu CFTR pierwotnie zachodzi w płucach
4. Jedyna możliwość to transfer in vivo – komórki płuc nie dają się

hodować in vitro

5. Pierwsze próby z użyciem wektorów adenowirusowych w 1993r
• Choroby płuc
• Konieczność ścisłej kontroli ilości dawki adenowirusów
6. Użycie liposomów jako wektorów o wiele bezpieczniejsze, jednak

efektywność transferu znacznie mniejsza